G蛋白偶联受体激酶4对大鼠血管平滑肌细胞AT1受体的调节作用

目的应用siRNA干扰抑制大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞G蛋白偶联受体激酶4(G protein-coupled recep-tor kinase 4,GRK4)的表达,探讨GRK4对血管紧张素Ⅱ1型(angiotensinⅡtype 1,AT1)受体的调节作用。方法免疫组化检测大鼠回结肠动脉血管平滑肌组织GRK4蛋白表达;以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10细胞株)为研究对象,免疫印迹检测GRK4、AT1受体蛋白表达变化,免疫共沉淀检测GRK4和AT1受体的相互作用和AT1受体磷酸化改变。结果大鼠动脉平滑肌组织GRK4表达良好;siRNA干扰后,GRK4蛋白表达明显下降(P<0.05);AT1蛋白表达降低(P<0.05),AT1受体磷酸化明显增强(P<0.05);GRK4和AT1受体存在共连接,抑制GRK4表达后增加GRK4与AT1受体之间的共连接。结论 GRK4能够调控大鼠胸主动脉平滑肌细胞AT1受体蛋白表达及其磷酸化状态,该调节作用可能与两者的共连接有关。     

核转录因子KLF4在肾脏缺血再灌注损伤中的表达与保护机制探讨

目的 研究核转录因子KLF4在肾脏缺血再灌注损伤中的表达,并对其保护作用的可能机制进行探讨.方法 Realtime-RT-PCR方法检测大鼠双肾在缺血1h,再灌注后不同时间点的KLF4表达情况,Western Blot方法检测KLF4在过氧化氢(H2O2)刺激的人胚肾细胞HEK293中的表达情况,采用基因转染技术过表达KLF4或抑制HEK293细胞中KLF4表达,观察KLF4的表达改变对H2O2损伤引起HEK293细胞死亡率的影响.结果 KLF4在大鼠肾脏缺血-再灌注时表达显著增高,在遭受H2O2损伤时,人胚肾细胞HEK293中KLF4的mRNA与蛋白表达也显著增高.过表达KLF4基因则能显著降低H2O2所致的HEK293细胞株的死亡率.抑制KLF4的表达能明显增加H2O2导致的HEK293肾细胞的死亡率.结论 KLF4极有可能是一个在肾脏缺血再灌注损伤过程中具有保护作用的核转录因子.     

G蛋白偶联受体激酶2活性和表达的调控

G蛋白偶联受体(G Protein-coupled Receptor,GPCRs)是一类重要的细胞表面受体,广泛存在于从真菌到哺乳动物几乎所有的有机体中,能通过传导细胞外信号参与调节许多生物学效应的蛋白质超家族。在激动剂持续存在的情况下,GPCRs介导的细胞内效应往往降低,产生失敏(减敏)状态。在触发迅速失敏的过程中,G蛋白偶联受体激酶(G Protein-coupled Receptor Kinases,GRKs)起关键作用。体外实验显示GRK2能磷酸化并调节多种GPCRs。探讨这些调控机制是理解不同生理、病理状态下GRK2如何参与GPCRs信号传导的重要理论基础。下面对GRK2的表达、亚细胞定位及调控机制进行简要综述,初步探讨它的病理生理学意义。     

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型中G蛋白偶联受体激酶5的表达

目的 观测G蛋白偶联受体激酶5 (G protein-coupled receptor kinase, GRK5) 在帕金森病α-synuclein转基因小鼠模型中的表达变化情况,了解GRK5在帕金森病中的可能作用,为发现帕金森病发病机制和探索更好的治疗方法提供新的方向.方法采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术对具有不同的人alpha synuclein(h-α-syn)表达水平的帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠以及3月龄,6月龄以及9月龄A53T突变型帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠脑组织进行GRK5的RNA和蛋白水平检测,与同窝阴性对照小鼠进行比较.结果各组帕金森病α-synuclein转基因小鼠与阴性对照小鼠相比,GRK5蛋白表达水平均有不同程度的增加,并且随着转入的h-α-syn蛋白表达水平的高低而有所变化.3月龄和6月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平没有变化;而9月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平都有所增加.结论帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠具有更高表达水平的GRK5.     

虾青素在小鼠肾脏缺血再灌注损伤方面的保护作用

目的:探讨虾青素(ATX)在小鼠肾脏缺血再灌注(IR)损伤方面的保护作用。方法:将雄性ICR小鼠随机分为4组:假手术组1(Sham)、假手术组2(Sham+ATX)、手术组1(IR)、手术组2(IR+ATX)。用灌胃法分别管饲等量ATX(5 mg·kg-1·d-1)和橄榄油2周,左肾蒂夹闭50 min诱导IR损伤。收集24 h后血清标本及肾脏组织。比较各组间血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr),肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化产物丙二醇(MDA)含量及肾脏的组织病理学评分。结果:IR+ATX组血清BUN、Cr较IR组显著下降(P<0.05),SOD较IR组明显升高(P<0.05),MDA较IR组明显降低(P<0.05);肾脏组织病理学评分IR+ATX组较IR组显著降低(P<0.05)。结论:ATX对肾功能及肾脏组织具有保护作用。     

大鼠肾脏缺血再灌注损伤中Intermedin及其受体表达的变化

目的 观察大鼠肾脏缺血/再灌注损伤(IRI)模型中,血管活性肽Intermedin(IMD)及其受体系统降钙素受体样受体(CRLR)、受体活性修饰蛋白(RAMPs)在肾组织表达的变化.方法 健康雄性Wistar大鼠16只随机分为假手术组和IRI组,双侧肾动脉夹闭45min、再灌注12h制备IRI模型.比色法测定血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)的浓度;放射免疫分析法测定血浆、肾组织IMD及血浆肾上腺髓质素(ADM)的含量;半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肾组织IMD、ADM、CRLR、RAMPs的mRNA表达.结果 与假手术组相比,IR1组大鼠SCr和BUN明显升高(P＜0.05);血浆和肾组织的IMD含量增加(分别升高了53.76%、36.85%),血浆ADM含量升高了143.22%(均P＜0.05);IRI组大鼠肾组织IMD、ADM、CRLR、RAMP1、2、3的mRNA表达较假手术组均上调(分别升高了22.1%、41.1%、32.8%、33.7%、35.9%、29.4%,均P＜0.05).结论 肾脏IRI过程中IMD及其受体系统表达增加,可能参与了肾脏IRI的病理生理过程.     

G蛋白偶联受体激酶2对EGF诱导的cAMP生成的调控

目的研究G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2）对表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）诱导cAMP生成的调控作用及其可能的机制.方法用放射免疫竞争法测定EGF刺激前后细胞内cAMP浓度.用免疫共沉淀的方法检测GRK2与EGF受体（EGF receptor,EGFR）的相互作用.结果（1）EGF刺激使HEK293细胞内第二信使cAMP的浓度显著升高,约是Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的30%～40%.而过表达GRK2后,EGF刺激诱导的cAMP的浓度升高仅为Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的不足10%（P＜0.01）,说明过表达GRK2能显著抑制EGF刺激的cAMP的生成.（2）免疫共沉淀实验的结果显示EGF刺激后,EGFR受体免疫沉淀复合物中检测到大量GRK2,说明EGF刺激能诱导EGFR-GRK2复合物的形成.结论GRK2对EGF刺激诱导的第二信使cAMP生成有负反馈调控作用,这种调控作用可能是通过EGF刺激的GRK2与EGFR的相互作用来实现的.     

SIRT1在小鼠肠缺血再灌注损伤中的作用分析

目的:探讨SIRT1在小鼠肠缺血再灌注损伤中的作用。方法:45只大鼠分为假手术组、模型组和SIRT1组。假手术组和模型组经腹腔注射空载体腺相关病毒,SIRT1组大鼠经腹腔注射过表达SIRT1的腺相关病毒。注射21 d后,模型组和SIRT1组大鼠采用肠系膜上动脉夹闭-松夹闭方式建立小肠缺血再灌注模型,假手术组大鼠仅做肠系膜上动脉分离。再灌注后24 h后处死大鼠,收集血清和小肠标本。采用ELISA试剂盒检测3组大鼠外周血炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平,采用试剂盒检测小肠组织中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平;采用Western blot分析3组大鼠小肠组织凋亡蛋白的表达水平;采用TUNEL染色分析小肠绒毛细胞凋亡指数。结果:与假手术组比较,模型组和SIRT1组大鼠外周血炎症因子水平(IL-1β、IL-6和TNF...     

Wistar大鼠急性肾脏缺血再灌注损伤动物模型的建立及意义

目的:建立一种简单?安全?高成功率的大鼠急性肾脏缺血再灌注损伤动物模型?方法:应用微型动脉夹夹闭Wistar大鼠双侧肾动脉50 min后松开,于伤后第3?5?7天取肾,经一系列处理后进行HE染色及免疫组化染色,以观察在肾脏近曲小管上皮细胞中是否出现肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,Kim-1)抗原及该细胞形态学改变?结果:该法造模成功率达93.3%,实验组肾脏近曲小管上皮细胞Kim-1抗原表达率上升,同时该细胞有明显细胞形态学改变(P > 0.05)?结论: 应用微型动脉夹夹闭Wistar大鼠双侧肾动脉可制备急性肾脏缺血再灌注损伤模型,且成功率高?方法简单?     

G蛋白偶联受体激酶4对内皮素B型受体的异常调节在原发性高血压发生中的作用

目的探讨G蛋白偶联受体激酶4(G protein-coupled receptor kinase 4,GRK4)对内皮素B型受体(endothelin receptor B,ETB)的异常调节在原发性高血压中的作用及机制。方法选用12~14周龄,体质量300 g左右的雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHRs)及其对照鼠(Wistar-Kyoto,WKY)各10只,通过无创鼠尾测压仪测定血压,采用右肾上腺静脉插管灌注ETB受体特异性激动剂BQ3020后观察尿流速及尿钠排泄率,荧光定量PCR检测大鼠肾脏GRK4 mRNA水平,Western blot测定大鼠肾脏GRK4及ETB受体的蛋白表达差异,免疫共沉淀法检测ETB受体磷酸化情况,在动物水平观察高血压状态下ETB受体的功能情况。结果 ETB受体激动剂BQ3020对WKY大鼠有明显利尿排钠作用,且这种利尿排钠作用可以被ETB受体抑制剂BQ788阻断,但在SHR大鼠BQ3020的利尿排钠作用受损[尿流速:(11.23±2.16)vs(3.49±1.32),P<0.05];尿钠排泄率:[(1 551.43±393.47)vs(601.16±128.15),P<0.05];在SHR大鼠肾皮质GRK4的蛋白水平及mRNA水平均较WKY大鼠高[蛋白:(1.38±0.10)vs(0.85±0.07),P<0.05];mRNA:[(2.23±0.15)vs(0.78±0.16),P<0.05],SHR大鼠ETB受体总蛋白水平与WKY大鼠相比差异无统计学意义(P>0.05),但ETB受体磷酸化水平增高。结论 GRK4可能通过对内皮素B型受体的异常调节,参与了原发性高血压发生与发病。     

G蛋白偶联受体在肝损伤中的作用研究进展

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是细胞表面最大的受体家族,广泛分布于人体的中枢神经系统、免疫系统、心血管系统、视网膜等器官和组织,参与机体的发育和正常功能的行使。肝脏是人体的重要器官,具有如代谢、解毒、分泌和排泄胆汁等许多功能。肝脏中存在的许多GPCR参与了肝脏许多的病理生理过程。本文就参与急慢性肝损伤的GPCR作一综述。     

缺血性急性肾衰病程中cyclin E和CDK2的作用

目的：探讨cyclin E和周期素依赖性激酶2（CDK2）在缺血性急性肾衰大鼠肾组织中的表达及其与肾小管上皮细胞增殖之间的关系。方法：急性肾衰大鼠分别在第0、2、7、10、14天处死，取血测定肌酐值，免疫组化法观察肾细胞增殖程度以及cyclin E和CDK2的分布，蛋白印迹法检测肾组织中cyclin E和CDK2蛋白表达。结果：大鼠血清肌酐值在缺血再灌注第2天时显著增高，第7天时最高，第10天时开始降低，第14天时基本降至正常。对照组肾组织的细胞增殖指数（PI）为0.7%，肾缺血后第2、7、10和14天分别为14.8%、30.9%、23.6%和12.4%。Cyclin E和CDK2蛋白在肾组织内主要分布于肾小管，且第2天表达弱阳性，第7和10天表达分别为强阳性和阳性，第14天表达减弱；两种蛋白的水平与免疫组化结果一致。两种蛋白表达水平和PI之间均呈正相关。结论：缺血性急性肾衰大鼠肾小管上皮细胞增殖与肾组织cyclin E和CDK2表达上调密切相关。     

MicroRNA在肾脏缺血再灌注损伤中的研究进展

MicroRNA(miRNA)是一类通过作用于靶基因mRNA发挥转录后基因调控活性的小分子非编码RNA,参与生物体内各种基本的生物学进程,它的异常表达与疾病的发生发展密切相关。近期的研究证实,肾脏缺血再灌注损伤(IRI)后多种miRNA异常表达,可能参与了肾脏IRI过程的调控。miRNA可调控内皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞中炎性介质的合成与分泌,从而影响肾脏IRI过程的炎症反应。同时,也有miRNA作用于凋亡与增殖相关基因,从而调控IRI时肾小管上皮细胞的凋亡与增殖。miRNA还可诱导内皮祖细胞的聚集,从而促进损伤肾组织的血管生成与修复。细胞外的研究显示,miRNA在血清和尿液中的即时变化可能反映了肾脏IRI的损伤程度。因此,miRNA可能会成为肾脏IRI的一种新的生物学标记物和潜在的治疗靶点。     

G protein-coupled receptor kinase 4 regulates expression and phosphorylation status of AT1 receptor in rat vascular smooth muscle cells

目的 应用siRNA干扰抑制大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞G蛋白偶联受体激酶4(G protein-coupled receptor kinase 4,GRK4)的表达,探讨GRK4对血管紧张素Ⅱ1型(angiotensinⅡtype1,AT1)受体的调节作用.方法 免疫组化检测大鼠回结肠动脉血管平滑肌组织GRK4蛋白表达;以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A10细胞株)为研究对象,免疫印迹检测GRK4、AT1受体蛋白表达变化,免疫共沉淀检测GRK4和AT1受体的相互作用和AT1受体磷酸化改变.结果 大鼠动脉平滑肌组织GRK4表达良好;siRNA干扰后,GRK4蛋白表达明显下降(P＜0.05);AT1蛋白表达降低(P＜0.05),AT1受体磷酸化明显增强(P＜0.05);GRK4和AT1受体存在共连接,抑制GRK4表达后增加GRK4与AT1受体之间的共连接.结论 GRK4能够调控大鼠胸主动脉平滑肌细胞AT1受体蛋白表达及其磷酸化状态,该调节作用可能与两者的共连接有关.     

肾缺血再灌注损伤中蛋白激酶C对巨噬细胞的影响

缺血再灌注损伤是器官移植不可避免的反应过程,其病理生理机制包括细胞凋亡、氧自由基生成、免疫系统活化、微血管功能障碍等.其中先天免疫是机体防御的第一道防线,也是关键环节,而巨噬细胞是肾脏缺血性先天免疫早期重要的起动子,在缺血再灌注损伤中发挥双剑作用.因此,在早期减轻巨噬细胞的浸润是目前的研究热点.而蛋白激酶C抑制剂能通过多途径作用减少移植肾内的巨噬细胞浸润,但目前具体机制尚不完全清楚.     

海鞘G蛋白偶联受体激酶cDNA的克隆

目的 从海鞘体内分离可能存在的编码G蛋白偶联受体激酶（GRK）的cDNA克隆，确定其分子特征、研究其转录产物表达情况。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、序列分析、3‘RACE等方法。结果 得到了海鞘的一种GRKcDNA克隆，将其命名为Ci-GRK1。从序列分析及分子遗传分析的结果可以看出Ci-GRK1与人类GRK5的同源性最高，其次是果蝇GRK2。Ci-GRK1mRNA在海鞘胚胎发育的整个过程及其在幼虫体内均有表达。结论 Ci-GRK1有可能在海鞘胚胎发育中起着非常重要的作用。     

锌预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤的预防作用

目的：探讨锌预处理对小鼠肾缺血再灌注损伤(RIRI)的预防作用,为RIRI的防治提供实验依据。方法：50只雄性小鼠随机分为假手术组、模型组、硫酸锌预处理高剂量组（高锌组,60 mg•kg^-1）、硫酸锌预处理中剂量组（中锌组,30 mg•kg^-1）和硫酸锌预处理低剂量组（低锌组,15 mg•kg^-1）,每组10只。各剂量锌处理组小鼠每日灌胃给予硫酸锌1次,连续2周。模型组和假手术组给予等体积生理盐水。2周后制备RIRI模型。缺血30 min再灌注24 h后取出肾脏组织,固定、包埋,HE染色观察病理组织学表现,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测c-Fos表达。结果：病理组织学表现,模型组小鼠肾脏组织中肾皮质可见肾小管管腔扩张,内可见管型,肾小管上皮细胞空泡变性和坏死,皮髓交界处髓质损伤较重,可见充血及成片坏死区。高锌组病理改变无改善,中锌和低锌组病理组织改变较轻,小鼠肾切片可见肾小管上皮细胞部分肿胀,皮髓交界处肾小管充血、细胞坏死较少,低锌组好于中锌组。TUNEL法结果,模型组凋亡细胞较多,显著高于低锌和中锌组（P<0.05）,低锌组凋亡细胞显著低于中锌组（P<0.05）。免疫组化结果,与假手术组相比较,模型组和锌预处理组c- Fos阳性细胞率显著增加 (P<0.05);与模型组比较,中锌和低锌组c- Fos阳性细胞率显著减少(P<0.05);低锌组c-Fos阳性细胞率显著低于中锌组（P<0.05）。结论：在一定剂量范围内,硫酸锌对RIRI所导致的肾功能损害具有保护作用,其机制可能与凋亡细胞减少、c-Fos表达降低有关。