重组腺病毒介导的p53基因对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的探索p53基因在肝癌基因治疗方面的可行性.方法以人肝癌细胞系SMCC-7721为实验对象,将载有人野生型p53 cDNA的重组腺病毒(Ad-p53)感染SMCC-7721细胞及肿瘤组织,体外体内实验观察Ad-p53对SMCC-7721细胞生长的影响.结果Ad-p53对SMMC-7721细胞的抑制作用与感染浓度有关,MOI值越高,抑制作用越强.当Ad-p53在100 MOI效靶比时,SMCC-7721细胞基本达到完全抑制.感染2 d后P53蛋白表达达到高峰,SMCC-7721生长受到明显的抑制.瘤内注射Ad-p53后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小.结论Ad-p53转导野生型p53基因可能是一种有效的肝癌基因治疗途径.     

AEG-1对裸鼠肝癌模型中肝癌细胞生长及肺转移的影响

摘要:目的 研究过表达和沉默 AEG-1基因对肝癌细胞生长的影响,以及 AEG-1基因在调节肝癌细胞定向肺转移 中的作用。方法 分别以携带过表达 AEG-1序列及对照基因序列的慢病毒(lentivirus)转染 SMMC-7721肝癌细胞株 (SMMC-7721-AEG-1-L;SMMC-7721-control-L);以携带shRNAAEG-1及对照shRNA 质粒(plasmid)转染SMMC-7721 细胞株(SMMC-7721-shAEG-1-P;SMMC-7721-control-P);使用实时定量 PCR 和 Westenblot检测 AEG-1的表达;随后 使用荧光素酶基因慢病毒包装颗粒转染上述4种稳定转染细胞株。使用上述细胞株分别建立3种裸鼠肝癌模型:皮下 移植瘤模型,原位移植瘤模型和血行播散模型;每种细胞株每一模型5只 Balb-c裸鼠,共60只。建立皮下移植瘤模型, 观测肿瘤的生长情况并绘制肝细胞肿瘤生长曲线;建立肝癌原位移植瘤和血行播散模型,采用生物发光活体成像技术及 组织病理学方法监测造模成功率及肿瘤在肝内、肝外转移情况。结果 通过肝癌皮下移植瘤模型可观察到 AEG-1过表 达组肿瘤体积显著高于对照组,且裸鼠肝脏组织出现弥漫性侵袭转移灶;在肝癌原位移植瘤和血行播散模型中可观察到 AEG-1过表达/沉默可以导致肝癌细胞肝内转移、肺转移率和转移灶数量显著增高/降低。结论 过表达 AEG-1基因可 促进肝癌细胞生长以及定向肺转移,沉默 AEG-1基因抑制肝癌细胞生长及定向肺转移。     

生物发光人肝癌裸小鼠原位癌模型的构建

目的选用稳定表达荧光素酶报告基因的人源性肝癌细胞株(HCCLM3-Luc),构建人肝癌细胞株原位癌荷瘤裸鼠动物模型。方法活体成像仪定量分析不同细胞数量HCCLM3-Luc的荧光强度表达情况,并检测各细胞数量的荧光素酶活性,探索HCCLM3-Luc荧光素酶产生的光子量与肿瘤细胞数量之间的线性相关性。采用肝叶原位接种HCCLM3-Luc瘤块组织和尾静脉注射HCCLM3-Luc细胞悬液,分别构建人肝癌裸小鼠原位癌模型;比较两种方法构建人肝癌细胞株原位癌裸鼠模型的可行性,并优化模型构建中的关键因素。结果 HCCLM3-Luc细胞数量的成正相关,(相关系数R~(2 )=0.9989,直线方程式:Y=1155.8X+1×10~6),平均ROI值约为每个细胞140光子/s。采用肝叶原位接种组的原位瘤成瘤率[(82.5±7.2)%]明显高于尾静脉注射[(34.1±13.2)%]。结论本课题构建了生物发光人肝癌细胞株原位癌裸鼠模型,该模型可采用小动物成像仪实时监测肿瘤生长情况。     

人肝癌原位移植瘤的活体动态观察

目的 建立GFP（绿色荧光蛋白）/Luciferase（荧光素酶,Luc）双标高效表达的人肝癌细胞系SMMC-7721-GFP/Luc,并建立该细胞的裸小鼠肝原位移植瘤动物模型,利用小动物活体成像系统观察裸小鼠肝原位移植瘤的生长及转移情况.方法 应用慢病毒转染的方法建立GFP/I.alC双标的SMMC-7721细胞系,接种于裸小鼠肝原位,采用活体成像技术监测该细胞在小鼠体内深部组织的表达情况.结果 成功建立了GFP/Luc双标表达率接近100%的SMMC-772l-GFP/Luc细胞系,进行裸小鼠肝原位移植后,应用活体成像系统可观察到裸小鼠肝原位早期的微小病灶和晚期移植瘤的生长情况.而且,随着肿瘤移植时间的延长,移植瘤体积的增大,活体成像检测到的发光面积逐渐增大,发光强度也逐渐增加.结论 活体荧光成像系统可直接观察肝原位移植瘤模型中肿瘤的生长及转移,有助于了解人肝癌的生物学行为及其特性,鉴于其敏感、直观,动态、可靠的优点,它将为肝癌的进一步研究提供极其有益的帮助.     

两种方法构建自发转移且便于观察的裸鼠原位肝癌模型

目的构建Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞株,两种方法建立方便观察且自发转移的裸鼠原位肝癌模型。方法构建p CDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro重组慢病毒表达载体,并转染人肝癌细胞株HCCLM3,通过细胞悬液肝左叶注射法或皮下移植瘤组织块肝内植入法构建裸鼠原位肝癌模型,利用活体成像技术和组织病理学比较两种方法肿瘤的生长和转移情况。结果构建稳定表达荧光素酶(Luc)和绿色荧光蛋白(GFP)的高转移性人肝癌细胞株HCCLM3-Luc-GFP,裸鼠活体成像和病理学结果发现,两种方法建立的原位肝癌模型成瘤率均为100%。其中细胞悬液法建模周期短,对宿主肝的损伤小,更能模拟出肝癌患者的微环境,转移率高;而肿瘤组织块法的成瘤大小和位置较易控制,但转移率较低。结论成功构建Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞系HCCLM3-Luc-GFP,细胞悬液法和肿瘤组织块转接法分别建立了自发转移且便于观察的裸鼠原位肝癌模型,为连续、直观地监测肿瘤的生长转移,评价抗肝癌生长转移药物的疗效奠定了基础。     

Mmp-2重组真核表达载体的构建及MMP-2蛋白对肝癌细胞的作用机制探讨

目的：构建人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）基因重组真核表达载体,探讨MMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法：以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型,以基因重组技术构建pEYFP-Mmp-2重组真核表达载体,pEYFP-Mmp-2一过性转染模型细胞过表达MMP-2-YFP,siRNA转染沉默模型细胞内源性MMP-2表达,设立空白对照、MMP-2沉默对照组、MMP-2沉默组、过表达MMP-2融合蛋白对照组、过表达MMP-2融合蛋白组,划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭小室实验检测细胞侵袭能力,钙蛋白酶（calcium-activated neutral protease,Calpain）特异性抑制剂Calpeptin抑制Calpain活性,蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2-YFP、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vi－mentin）表达变化。结果：成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2。pEYFP-Mmp-2转染过表达MMP-2融合蛋白组细胞高表达MMP-2-YFP。与MMP-2沉默对照组相比,MMP-2沉默组内源性MMP-2表达明显下调（P=0.000）,细胞12 h、24 h及48 h迁移率明显降低（P=0.000或P=0.001）,48 h侵袭率明显降低（P=0.004）,E-cadherin表达明显上调,N-cadherin及Vimentin表达明显下调（P=0.000）。与过表达MMP-2融合蛋白对照组相比,过表达MMP-2融合蛋白组12 h、24 h及48 h迁移率明显增强（P=0.015或P=0.001）,48 h侵袭率明显升高（P=0.011）,细胞E-cadherin表达明显下调,N-cadherin及Vimentin表达明显上调（P=0.003或P=0.001）。Calpeptin预处理明显降低过表达MMP-2融合蛋白组细胞迁移率和侵袭率（P=0.000）,上调E-cadherin,下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达水平（P=0.000）。结论：本实验通过基因重组技术成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2,成功表达MMP-2-YFP 融合蛋白;并发现MMP-2通过调节Calpain介导肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭及EMT。     

荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较

目的利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型,及小鼠肝原位移植模型的生物发光和小动物PET-CT成像的比较。方法构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入人肝癌细胞BEL-7402,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆并扩大培养。BALB/cA-nu裸鼠肝门静脉接种5×105个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像和小动物PET-CT成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达Luc的人肝癌细胞株,将其接种到裸鼠体内,活体荧光成像系统观察发现能够成瘤,小动物PET-CT影像观察发现小鼠肝脏边缘对18 F-FDG有高摄取区域。结论利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型,小动物活体成像结合小动物PET-CT技术为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术,为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。     

甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡的诱导作用

目的 探讨甘草酸苷对肝癌细胞SMCC-7721凋亡诱导作用及相关机制.方法 以甘草酸苷(0、10、30、100μg/mL)处理肝癌细胞SMCC-7721 48 h后,咪唑蓝(MTT)法检测肝癌细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位;紫外分光光度法检测细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspase-9活性的影响;Western blot分析线粒体途径中相关蛋白p53、细胞色素C(CytC)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关蛋白(Bax)的表达.结果 与阴性对照比较,10、30、100 μg/mL甘草酸苷可显著降低细胞的活力(P＜0.01),诱导细胞凋亡(P＜0.01),促进线粒体膜电位去极化(P＜0.01),抑制肝癌细胞SMCC-7721Caspase-3、Caspase-9活性(P＜0.01),并上调p53、CytC、Bax的表达(P＜0.01),下调Bcl-2的表达(P＜0.01),且作用呈现浓度依赖关系.结论 甘草酸苷可通过线粒体途径诱导肝癌细胞SMCC-7721凋亡.     

白藜芦醇对食管鳞癌Eca-109细胞侵袭迁移及EMT的影响

目的:研究白藜芦醇(RES)对食管鳞癌Eca-109细胞侵袭迁移及上皮间质转化(EMT)的影响.方法:用不同浓度(50和100 μmol/L)的RES处理Eca-109细胞,采用细胞划痕实验、Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力,荧光定量PCR检测EMT蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和MMP-2、MMP-9 mRNA的表达,Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白表达.结果:与对照组比较,RES各浓度(50 μmol/L和100 μmol/L)组均可明显抑制Eca-109细胞侵袭迁移(P<0.01),下调N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达(P<0.05~P<0.01),增加E-cadherin mRNA和蛋白表达(P<0.01).结论:RES抑制Eca-109细胞侵袭迁移能力,其机制可能通过下调MMP-2、MMP-9的表达,调控EMT蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达、抑制上皮间质转化过程.     

西奥骨化醇抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化

目的 研究西奥骨化醇(seocalcitol,EB1089)对TGF-β1诱导肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的抑制作用.方法 用不同浓度维生素D类似物EB1089(1、10、100、1 000 nmol/L)作用于肝癌细胞SMMC-7721 6、12、24、48 h,筛选出具有统计学意义的作用浓度和时间.将肝癌细胞SMMC-7721分为4组(EB1089组、TGF-β1组、EB1089+TGF-β1组和空白对照组),分别干预48 h.用相差倒置显微镜观察细胞形态变化;通过实时RT-PCR和Western blot分别检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达情况;迁移实验和侵袭实验检测EB1089对肝癌细胞SMMC-7721侵袭和迁移能力的影响.结果 TGF-β1作用后肝癌细胞SMMC-7721呈现长梭形,并伸出较多触角,EB1089能明显改善这种形态变化;EB1089可有效升高TGF-β1所致的E-cadherin mRNA和蛋白低表达(P＜0.05),同时降低N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表达(P＜0.05);EB1089对TGF-β1诱导的细胞侵袭、迁移具有抑制作用(P＜0.05).结论 维生素D类似物EB1089能有效抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞SMMC-7721上皮-间质转化现象和侵袭、迁移能力.     

2001年我国医药研究的若干进展

随着国内外生命科学和生物技术等的飞速发展,我国医药技术在2001年取得了长足的进步。提前完成了我国所承担的人类基因组汁划中的1％测序任务,到2000年,中国科学家在功能基因研究和基因组多样性领域共完成研究论文1850篇,遍及医药各领域,研究手段和水平可于国际先进水平媲美,中国完全有条件在“后基因时代”成为主角之一。     

小儿耳鼻喉手术麻醉的新进展

因小儿耳鼻喉手术刺激强,时间短,且常与气道相关,故麻醉的控制有一定难度,现对国内外现阶段小儿耳鼻喉手术麻醉的改良方法及新观点进行评述,以期对临床工作有较好的指导意义。     

成都市属医院1，175例儿童支气管肺炎住院费用分析

为探讨成都市不同级别医疗机构儿童支气管肺炎单病种费用水平以及不同收费项目占总费用的比例特点及控制医疗费用的有效途径,为患者自主选择就诊医疗机构提供参考指导,对成都市卫生局所属不同级别医院儿童支气管肺炎住院医疗费用分析如下。1资料与方法1.1资料来自成都市卫生局2     

Malaria in children in Birmingham in the 1970s

Thirty-two children with malaria were admitted to Dudley Road Hospital, Birmingham, in the 1970s. None was admitted before 1974 and there was a rapid increase after that. All the infections were due to Plasmodium vivax and occurred in children of Asian immigrant families who had been born in or had visited India or Pakistan apart from one infant born in England who acquired the disease transplacentally. All presented within 12 months of entering or re-entering the United Kingdom. The clinical features of the 32 patients have been analysed and it is suggested that more effort should be made to educate travellers about the need for anti-malarial chemoprophylaxis and the necessity to continue it for one month after return.     

2005年广西流动人口疟疾监测结果分析

目的了解广西流动人员疟疾流行现状,进而提出针对性防治措施。方法收集全区网络直报疫情资料和各级疾病预防控制机构疟疾监测数据进行分析。结果2005年广西流动人口发热病人平均疟原虫阳性率为0·33%。80·62%的病人为本地居民外出到疟疾流行区务工感染所致。以从事护林/砍伐比例最高,占44·19%。结论加强返乡流动人口疟疾监测是巩固广西疟疾防治的关键所在。