蔓荆子黄素对小鼠单核巨噬细胞 增殖和凋亡的影响

目的 通过蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞活性及RAW264.7 细胞增殖和凋亡作用的研究,探讨蔓荆 子黄素对单核巨噬细胞的影响。方法 分别用含有不同浓度蔓荆子黄素作用于小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠单核巨噬 细胞RAW264.7,于24、48 及72 h 后采用CCK-8 检测细胞活性。使用AO/EB 染色观察RAW264.7 细胞凋亡 变化;应用流式细胞仪检测RAW264.7 细胞凋亡率。通过荧光探针DCFH-DA 检测RAW264.7 细胞活性氧 水平,使用JC-1 染色标记线粒体膜电位的变化。结果 CCK-8 法检测结果显示,蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞 的细胞活性及RAW264.7 细胞的增殖都有抑制作用,呈剂量与时间依赖关系,尤其对具有增殖能力的RAW264.7 细胞活性抑制作用更强。AO/EB 染色结果显示,RAW264.7 细胞经浓度为5 及10 μmol/L 的蔓荆子黄素处理后, 细胞表现为凋亡形态;流式细胞仪检测结果显示,蔓荆子黄素诱导RAW264.7 细胞Sub-G1 期代表凋亡细胞 的百分比增加（P <0.05）。蔓荆子黄素作用于RAW264.7 细胞后,细胞内活性氧水平提高;JC-1 染色结果显示, 蔓荆子黄素能使RAW264.7 细胞的线粒体膜电位下降。结论 蔓荆子黄素能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞与小鼠 单核巨噬细胞RAW264.7 活性,尤其对具有增殖能力的RAW264.7 细胞活性抑制作用更强,可以促进其凋亡, 其作用机制与增加细胞内活性氧水平和降低线粒体膜电位有关。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6对小鼠巨噬细胞凋亡的诱导作用

【目的】研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）分泌蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）对小鼠巨噬细胞凋亡的影响及机理。【方法】应用流式细胞仪分析稳定表达ESAT-6和经重组ESAT-6蛋白作用的小鼠RAW264.7细胞的凋亡;应用Caspase-3检测试剂盒检测caspase-3活性变化;进一步应用Western blotting分析稳转细胞系ESAT-6表达情况。【结果】RAW-EGFP-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和RAW-EGFP细胞系（P〈0.05）;RAW-flag-ESAT-6细胞系培养48 h后的凋亡率与caspase-3活性显著高于RAW264.7和相应对照细胞系（P〈0.01）。10μg/ml重组ESAT-6可显著诱导RAW264.7细胞凋亡,而5μg/ml重组ESAT-6无明显诱导细胞凋亡效果。稳转细胞系RAW-flag-ESAT-6细胞内flag-ESAT-6浓度大约只有500 ng/ml。【结论】胞内低水平表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。     

鼠、人源巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及比较

 目的 建立鼠、人源巨噬细胞源性泡沫细胞模型并比较其生物学特征。方法 体外培养鼠源RAW264.7和人源 THP-1巨噬细胞,经氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein,ox-LDL）刺激后,油红O染色,于荧光倒置显微镜下观察泡沫细胞形态及脂质富集情况。采用qRT-PCR技术检测ox-LDL对细胞内炎性因子表达的影响;流式细胞术检测ox-LDL对细胞凋亡的影响;酶标仪分别检测ox-LDL对细胞内脂质过氧化标志物活性氧（reactive oxygen species,ROS）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平的影响;HPLC检测ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞内催化色氨酸沿犬尿氨酸途径（kynurenine pathway,KP）分解代谢的限速酶吲哚胺2,3-双加氧化酶1（indoleamine 2,3 dioxygenase 1,IDO1）活性的影响。结果 鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬细胞经ox-LDL处理后,大量脂质在细胞内富集沉积,形成泡沫细胞。ox-LDL既可诱发巨噬细胞内炎性因子高表达,也会引起ROS和MDA水平显著升高,表明ox-LDL可以诱导鼠源RAW264.7和人源 THP-1巨噬细胞内炎症反应和脂质过氧化产生。ox-LDL更容易引发人源THP-1巨噬细胞的凋亡,而对鼠源RAW264.7巨噬细胞凋亡却无明显影响。ox-LDL在鼠源RAW264.7和人源 THP-1巨噬细胞中均可激活KP。结论 鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬细胞均可通过ox-LDL处理来建立稳定的鼠、人源巨噬细胞源性泡沫细胞模型。     

超声辐照对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察超声波辐照对培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和凋亡的影响,筛选防止介入治疗后血管再狭窄的辐照参数,并探讨其机理.方法:单声源压电陶瓷超声辐照系统声强连续可调,台盼蓝排斥实验分析辐照后即刻细胞存活率;MTT比色法描述辐照后5天VSMCs的生长动力学变化;BrdU掺入法检测辐照对VSMCs S期DNA复制的影响;ELISA法检测辐照后VSMCs凋亡情况.结果:1.超声辐照对培养的VSMCs有直接杀伤作用,该作用随辐照强度和辐照时间的增加而增加,相同辐照强度和时间下,低频超声该作用更显著.2.超声辐照组较对照组VSMCs生长曲线平缓,0.705MHz组以0.5W/cm2,5min辐照最为明显.3.BrdU掺入法测定S期细胞增殖发现,0.705MHz,0.5W/cm2,5min辐照组BrdU%低于对照组(40.5%±6.8%vs55.8%±3.3%,P＜0 05).4.0.705MHz,0.5W/cm2,5min辐照的凋亡富积因子与阳性对照相比为1.851±0.087vs1.924±0.074,P=0.836.结论:0.705MHz,0.5W/cm2,5min超声辐照在无明显杀伤细胞的情况下诱导培养的VSMCs凋亡,阻止VSMCs S期DNA复制,提示USE是一种潜在的治疗介入治疗后血管再狭窄的手段.     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

亲环蛋白A对氧化低密度脂蛋白诱导RAW264.7细胞活化与凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨亲环蛋白A (cyclophilin A,CyPA)对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein ,ox LDL）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7活化和凋亡的影响。方法: 体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,蛋白质印迹法检测40 mg/mL ox LDL诱导后RAW264.7细胞CyPA的表达。转染siRNA沉默CyPA的表达,转染阴性对照siRNA作为阴性对照组,使用40 mg/L ox LDL处理细胞24 h后,通过流式细胞术检测各组巨噬细胞表面标志CD80和CD86的阳性率、细胞凋亡率。结果： 与空白对照组相比,ox LDL干预24 h后RAW264.7细胞CyPA表达量显著增高。沉默CyPA表达后,与阴性对照组相比,CyPA沉默组在ox LDL干预24 h后CD80、CD86的表达明显降低,细胞凋亡明显减少。结论： CyPA可能参与介导ox LDL诱导的RAW264.7细胞活化与凋亡。     

Daxx在介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的 初步探讨Daxx在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡中的作用.方法 通过MTT比色法检测ox-LDL对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7)细胞生长的影响:用AO/EB染色、流式细胞仪和DNA断裂片段分析研究ox-LDL诱导的细胞凋亡.eal time PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达情况.结果 ox-LDL能抑制RAW264.7细胞的生长,抑制作用呈剂量-效应关系;50 mg/L ox-LDL处理RAW 264.7细胞48 h后,AO/EB染色细胞呈凋亡特征性改变,并且DNA断裂片段分析显示电泳图出现梯形条带;流式细胞检测显示相同时间不同浓度ox-LDL(0、12.5、25、50、75 mg/L)处理RAW264.7细胞48 h和相同浓度不同时间(50 mg/L,48、72 h)处理细胞,细胞凋亡率逐渐升高;Real time PCR结果表明不同时间和不同浓度的ox-LDL处理RAW264.7细胞后,Daxx mRNA表达水平呈时间和浓度依赖性增加,其中50 mg/L ox-LDL处理细胞48 h组Daxx mRNA表达最高.结论 ox-LDL有诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的作用,其机制可能与Daxx表达增高从而启动细胞凋亡有关.     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

低强度脉冲超声对脂多糖诱导炎性活化的RAW264.7巨噬细胞迁徙和吞噬的影响

目的 探讨低强度脉冲超声（LIPUS）对脂多糖（LPS）活化和未经活化的RAW264.7细胞迁徙和吞噬能力的影响。方法 LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症活化模型;通过CCK-8法研究LIPUS对不同环境下RAW264.7细胞活力的影响,划痕实验观察LIPUS对RAW264.7巨噬细胞迁徙的影响,Transwell实验观察LPS作为趋化因素时RAW264.7细胞趋化迁徙能力的变化情况,共聚焦显微镜及流式细胞术分析细胞内FITC荧光强度以探究巨噬细胞吞噬pHrodo Green标记的大肠埃希菌生物颗粒的能力。结果 成功构建活化RAW264.7炎症模型,筛选LPS浓度为100 ng/mL;LIPUS抑制未活化的RAW264.7巨噬细胞向划痕区域内迁徙和未活化巨噬细胞的趋化迁徙;但在当前参数下LIPUS不影响巨噬细胞的细胞活力和吞噬能力。结论 LIPUS抑制经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的迁徙,但不影响其吞噬作用。     

洛伐他汀对RAW264.7体外生长抑制作用的研究

目的通过细胞培养,观察洛伐他汀（lovastatin,LOV）对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的作用,探讨LOV对小鼠巨噬细胞株（RAW264.7）增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度（20,40,80μmol/L）LOV处理RAW264.7,作用不同时间（24 h,48 h,72 h）,以MTT法检测LOV对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响;观察洛伐他汀对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响。结果洛伐他汀对小鼠巨噬细胞瘤RAW264.7有明显的抑制生长的作用（P〈0.05）,细胞凋亡形态观察显示,经80μmol/L洛伐他汀作用的细胞出现明显固缩的凋亡小体。结论洛伐他汀能有效抑制巨噬细胞株的体外生长,其作用与剂量、时间具有一定的依赖性,这种抑制作用可能与洛伐他汀诱导细胞凋亡有关。