人端粒保护蛋白反义核酸抑制SGC7901胃癌细胞增殖

目的 研究人端粒保护蛋白（human protection of telomeres,hPOT1）对胃癌细胞生长增殖的作用.方法 利用本课题组先前所构建的hPOT1正、反义核酸真核表达载体,转染SGC7901胃癌细胞,G418筛选阳性克隆,用Western印迹法、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等技术观察基因转染后SGC7901细胞hPOT1蛋白的表达、细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡及细胞形态学的变化.结果 转染了hPOT1反义核酸真核表达载体（pcDNA-as-hPOT1）的SGC7901胃癌细胞hPOT1表达降低,生长减慢,阻滞于G2/M期,细胞凋亡增加.结论hPOT1反义核酸真核表达载体能显著抑制hPOT1蛋白的表达,hPOT1蛋白可能参与胃癌细胞的周期调控,并与细胞的生长增殖有关.     

反义核酸协同化疗药物抑制肝癌细胞的增殖

目的 研究以端粒酶催化亚基hTERT基因为靶的反义硫代寡核苷酸(ASODN)分别与三种常用化疗药物顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5—FU)、阿霉素(ADM)联合用药抑制人肝癌细胞HepG2增殖的作用。方法 以脂质体为载体,将ASODN转染至HepG2中,用四氮唑盐(MTT)法染色并计算联用ASODN及化疗药物对HepG2增殖的抑制率,用SAS统计软件及金正均Q值法进行数据分析。结果 单用DDP、5-FU、ADM时其IC_(50)分别为1.07、4.15和0.29μg/ml,加入0.1μmol/L的ASODN,IC_(50)下降为0.25、1.52和0.12μg/ml,与单用化疗药的抑制效果相比有明显增强(F分别为66.92、25.96和8.56,P<0.001);Q值分析表明ASODN分别与中低浓度的DDP(≤1μg/ml)、5—FU(≤10μg/ml)、ADM(≤0.1μg/ml)联用有较好的协同作用(Q≥1.15)。结论 ASODN分别与化疗药物DDP、5—FU、ADM联合用药,均可显著增强抑制HepG2增殖的效果。     

环氧合酶-2反义核酸抑制胃癌细胞的恶性表型

目的　通过环氧合酶 2 (COX 2 )反义核酸基因转染 ,逆转COX 2高表达的人胃癌细胞系中其表达水平 ,观察细胞生物学行为的变化情况 ,以初步探讨COX 2表达在胃癌发生中的某些具体机制。方法　使用脂质体介导的方法 ,用反义重组质粒及空载体分别转染COX 2异常高表达的人胃癌细胞系SGC 790 1(转染细胞分别命名为 790 1 AS及 790 1 P细胞 )。通过免疫细胞化学及RNA斑点杂交试验检测反义核酸转染的细胞中COX 2的蛋白及mRNA表达水平。四唑盐 (MTT)比色试验检测转染细胞的体外增殖速度。应用裸鼠成瘤试验比较转染前后细胞体内成瘤能力的差别。结果　免疫细胞化学及RNA斑点杂交试验证实 :在反义核酸转染的 790 1 AS细胞中COX 2的蛋白及mRNA水平均显著下调。MTT比色试验显示 790 1 AS细胞的增殖速度低于亲本SGC 790 1细胞。裸鼠成瘤试验表明 ,反义核酸转染细胞成瘤潜伏期延长 ,成瘤体积减小。 3组细胞接种裸鼠 30d后 ,瘤体的平均重量( x±s)分别为 (82 6 6 7± 77 6 7)mg(SGC 790 1细胞 ) ,(776 6 7± 30 0 0 6 )mg(790 1 P细胞 )和 (486 6 7±15 2 8)mg (790 1 AS细胞 )。转染反义核酸的细胞成瘤性显著低于未转染细胞及转染载体对照细胞(P <0 0 1)。结论　胃癌细胞中过表达的COX 2与细胞的恶性表型相关。用     

血管内皮生长因子受体2反义核酸体内抑制人乳腺癌生长作用研究

目的 探讨血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/KDR)反义寡核苷酸(asONs)在体内对人乳腺癌生长的抑制作用. 方法构建MCF-7乳腺癌裸鼠模型,将14只裸鼠随机分为生理盐水对照组及反义核酸(asON4)组,asON4按50 mg/kg剂量腹腔注射,1次/d,共20 d;对照组给予相应体积的生理盐水.给药过程中测量各组裸鼠瘤结节的大小;21 d时收集肿瘤标本,免疫组化法检测移植瘤的增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平. 结果在荷瘤鼠模型中,KDR反义核酸组瘤结节生长变慢,瘤结节大小及移植瘤PCNA阳性细胞数明显低于生理盐水对照组(P<0.05). 结论 KDR反义核酸显著抑制KDR蛋白表达,在体内抑制了乳腺癌增殖.     

siRNA沉默水通道蛋白5基因抑制人肝癌细胞的生长作用

目的 通过采用小干扰RNA(siRNA)靶向作用人肝癌细胞Bel-7402中的水通道蛋白5(AQP5)基因,观察其对Bel-7402的增殖及凋亡的作用。方法 体外孵育Bel-7402,采用阴性对照siRNA(siRNA-NC)、siRNA-AQP5#1、siRNA-AQP5#2转染细胞。实验设置细胞为对照组、siRNA-NC组、sliRNA-AQP5#1组、siRNA-AQP5#2组。噻唑蓝染色检测细胞的增殖能力;流式细胞技术测定细胞的凋亡情况;蛋白免疫印迹技术和Real time-PCR测量细胞中AQP5蛋白和mRNA的含量。结果 siRNA-NC组与对照组相比,细胞的增殖、凋亡及AQP5蛋白和mRNA的含量无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,siRNA-AQP5#1组、siRNA-AQP5#2组的细胞的增殖力降低、凋亡率升高、AQP5蛋白和mRNA的含量均降低(均P<0.05)。结论 siRNA靶向作用人肝癌细胞AQP5基因通过降低其增殖和升高其凋亡率达到抑制癌细胞的生长作用。     

人宫颈癌基因在消化系肿瘤中的表达及其临床意义

人宫颈癌基因（HCCR）是在宫颈癌中发现的一个新的癌基因，可能通过负向调节p53而促进肿瘤发生。目的：检测HCCR在人胃癌、结肠癌、肝癌中的表达，探讨其与肿瘤临床病理特征的关系。方法：以免疫共沉淀法检测HCCR在消化系肿瘤患者外周血中的表达，以细胞免疫荧光和免疫细胞化学染色检测HCCR在消化系肿瘤细胞株中的定位和表达．以免疫组化方法检测HCCR在肿瘤组织中的表达，并分析其与肿瘤临床病理特征的关系。结果：HCCR在消化系肿瘤患者外周血中有表达，肿瘤细胞株中其表达定位于细胞膜和细胞质。HCCR在人胃癌、结肠癌、肝癌组织中的阳性表达率显著高于相应正常或癌旁组织（P〈0．05）。HCCR的阳性表达率与胃癌部位和肝癌组织学分级显著相关（P〈0．05），与其他肿瘤临床病理特征均不相关。结论：HCCR在人消化系肿瘤细胞和组织中表达较强，可能与肿瘤的发生、发展有关，有望成为消化系肿瘤诊断的标记物。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究

细胞凋亡(Apoptosis)是由基因控制的细胞主动死亡方式.应用药物选择性诱导肿瘤细胞凋亡能改善肿瘤的预后[1].染色体端粒(Telomere)是位于细胞染色体末端的一种特殊结构,在人体细胞中,端粒由串联的短片段重复序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组成,在染色体的定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面起重要作用,并与细胞凋亡密切相关[2].端粒酶 (Telomerase)是一种核糖核蛋白,它通过不断合成端粒重复序列添加至染色体末端,维持染色体稳定.Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是一种癌基因,可抑制多种因素引起的细胞凋亡,Bcl-2蛋白高表达是端粒酶激活的途径之一[3].我们旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASDDN-t)诱导肝癌细胞凋亡[4],抑制端粒酶活性,从而抑制肝癌细胞的生长,为肝癌基因治疗提供依据.     

柴胡及肝细胞生长刺激物质对人传代肝癌细胞的作用

应用传代人肝癌细胞株(QGY—7703),发现人胎肝细胞生长刺激物质能独立启动人肝癌细胞DNA 增殖;所用中药仅柴胡出现延迟刺激活性,其它药物无类似作用。协同用药亦无明显增强作用.     

抗基因及反义寡脱氧核苷酸抑制N—ras表达及对肝癌细胞增殖的影响

目的 探讨抗基因及反义寡核苷酸对肝癌的潜在治疗作用。方法 合成了针对Ｎ－ｒａｓ转录，翻译起始区的１２ｍｅｒ硫代磷酸抗基因寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＯＤＮａｎ），１９ｍｅｒ硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＯＤＮＡａｓ）采用ＥＬＩＳＡ，斑点杂交法分别检测寡脱氧核苷酸处理的肝癌ＢＥＬ７４０２细胞内ｐ２１，Ｎ－ｒａｓｍＲＮＡ水平，观察了ＢＥＬ７４０２肝癌细胞生长的影响。结果 处理细胞内Ｎ－ｒａｓｍＲＮＡ水平低于对照     

HCCR-2反义真核表达载体对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响

目的构建HCCR-2反义真核表达载体,研究其对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响。方法通过MTT实验、流式细胞技术、平皿克隆形成实验、Millicell迁移实验分别检测HepG2肝癌细胞经HCCR-2反义真核表达载体转染前后细胞生长速度、单个细胞形成克隆能力、迁移能力的变化。结果MTT实验表明反义转染组细胞HepG2-H增殖能力明显低于HepG2组和HepG2-P组;流式细胞生长周期实验表明,与HepG2和HepG2-P细胞相比,HepG2-H组细胞增殖指数下降,细胞阻滞于G0／G1期,HepG2-H组单个细胞形成克隆的能力与HepG2组和HepG2-P组相比显著降低;Millicell迁移实验表明,HepG2-H细胞较HepG2和HepG2-P细胞迁移明显减少。结论HCCR-2反义真核表达载体可以明冠抑制HepG2肝癌细胞增殖速度、单个细胞形成克隆能力、体外迁移能力。     

人端粒酶反义寡核苷酸抑制三种不同分化程度胃癌细胞生长及作用机制研究

目的 研究特定序列人端粒酶反义寡核苷酸(AS-0DN)抑制三种分化程度不同的胃癌细胞(MKN-45、SGC-7901、MKN-28)生长的可能性，并阐述其抑制胃癌细胞生长的作用与胃癌细胞分化程度的相关性。方法 在指定的作用时问和浓度等条件下，以AS-0DN作用于不同分化程度的三种胃癌细胞，用改良端粒酶活性定量检测法测定AS-0DN片段作用前后胃癌细胞的端粒酶活性；用锥虫蓝染色法观察细胞活力；用倒置显微镜、电镜、流式细胞仪和原位末端标记(TUNEL)法观察细胞凋亡情况。结果以指定浓度的AS-ODN作用后，MKN-45和SGC-7901细胞出现明显的端粒酶活性和细胞生长抑制(P＜0．05)，但在同样浓度条件下，MKN-28胃癌细胞只出现端粒酶活性抑制。错义序列对照组则无明显变化。以10 μmol／L的AS-ODN连续作用三种胃癌细胞96h后，光镜、电镜和TUNEL法检测均发现MKN-45和SGC-7901细胞表现出特有的凋亡征象，流式细胞仪检测证实MKN-45和SGG-7901细胞的平均凋亡率在44．75％和33．56％，错义序列对照组则无明显变化(P＜0．05)。结论 AS-0DN能有效抑制胃癌细胞生长，其作用机制主要是抑制端粒酶活性和诱导细胞凋亡。AS-0DN对中分化胃癌细胞的生长抑制最显著，对低分化胃癌细胞的抑制作用略强于高分化胃癌细胞，提示端粒酶反义核酸的抑制作用不依赖于胃癌细胞的分化程度。     

Molecular mechanisms of apoptosis induced by Scorpio water extract in human hepatoma HepG2 cells

AIM: To clarify the mechanism underlying the anti-mutagenic and anti-cancer activities of Scorpio water extract (SWE). METHODS: Human hepatoma HepG2 cells were incubated with various concentrations of SWE. After 24-h incubation, cytotoxicity and apoptosis evaluations were determined by MTT and DNA fragmentation assay, respectively. After treatment with SWE, mitochondrial membrane potential (MMP) was determined by measuring the retention of the dye 3,3'-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6(3)) and the protein expression including cytochrome C and poly-(ADPribose) polymerase (PARP) were measured by Western blotting. Caspase-3 and -9 enzyme activities were measured using specific fluorescence dyes such as Ac-DEVD-AFC and Ac-LEHD-AFC. RESULTS: We found that treatment with SWE induced apoptosis as confirmed by discontinuous DNA fragmentation in cultured human hepatoma HepG2 cells. Our investigation also showed that SWE-induced apoptosis of HepG2 cells were associated with intracellular events including disruption of MMP, increased translocation of cytochrome C from mitochondria to cytosol, activation of caspase-3, and PARP. Pre-treatment of N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (Ac-DEVD-CHO), a caspase-3 specific inhibitor, or cyclosporin A (CsA), an inhibitor of MMP disruption, completely abolished SWE-induced DNA fragmentation. CONCLUSION: These results suggest that SWE possibly causes mitochondrial damage, leading to cytochrome C release into cytosol and activation of caspases resulting in PARP cleavage and execution of apoptotic cell death in HepG2 cells. These results further suggest that Scorpio may be a valuable agent of therapeutic intervention of human hepatomas.     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

肺癌抑癌基因1对HepG2细胞生长的抑制效应

目的探讨肺癌抑癌基因1（TSLC1）对人肝癌细胞株HepG2生长的影响。方法RT-PCR法制备TSLC1全长cDNA并克隆至真核表达载体pCI-neo，稳定转染至肝癌细胞系HepG2中。以转染空质粒pCI-neo的HepG2细胞为对照组，野生型HepG2细胞为空白组，显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖，FACSort流式细胞仪检测细胞周期，AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡情况。结果实验建立了高表达TSLCI蛋白的稳定细胞株。实验组细胞呈多角形，聚集成团，细胞之间的黏附非常紧密，对照组和空白组细胞呈梭形，细胞与细胞之间较疏散。与对照组和空白组相比，实验组细胞株细胞生长速度减慢，增殖受到明显抑制，G0／G1期细胞为63．66%±3．83％，高于对照组（47．45％±0．91％）和空白组（54．47％±0．96％）；S期细胞数为22．90％±6．04％，低于对照组（36．58％±0．61％）和空白组（33．61％±2．99％），P〈0．01，实验组细胞周期发生了G0/G1期阻滞。实验组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别为17．09%±0．20％和16．11％±0．40％，与对照组和空白组细胞相比均明显升高（P〈0．01）。结论TSLC1基因明显抑制HepG2细胞生长，并诱导细胞发生凋亡。     

人肝癌细胞系HepG2在遗传毒物检测中的应用及其进展

外来化合物的体外遗传毒性实验常用于各种致癌物和致突变物的快速筛选.HepG2是一种分化好的人肝胚细胞瘤细胞系,保留了较完整的代谢酶及其活性.以HepG2细胞作为实验系统检测各种致癌及非致癌物,在多个观察终点均获得相应的阳性及阴性结果.     

人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体。方法从人肝癌细胞株HepG2提取RNA，利用RT-PCR方法，克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段，并将其与T载体连接，测序证实无误后，用SalⅠ、SacⅡ双酶切重组T载体，然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点，最后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定。结果RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到pIRES2-EGFP载体上。结论成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2（-）。     

Exogenous phosphatidylethanolamine induces apoptosis of human hepatoma HepG2 cells via the bcl-2/bax pathway

AIM： To investigate the signaling pathways implicated in phosphatidylethanolamine （PE）-induced apoptosis of human hepatoma HepG2 cells. METHODS： Inhibitory effects of PE on human hepatoma HepG2 cells were detected by 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） assay. Cell cycle, apoptosis and mitochondrial transmembrane potential （△ψm） were analyzed by flow cytometry. Immunocytochemical assay and Western blotting were used to examine Bcl-2, Bax and caspase-3 protein levels in HepG2 cells treated with PE. RESULTS： PE inhibited the growth of HepG2 cells in a dose- and time- dependent manner. It did not affect the cell cycle, but induced apoptosis. PE significantly decreased △ψm at 0.25, 0.5 and 1 mmol/L, respectively, suggesting that PE induces cell apoptosis by decreasing the mitochondrial transmembrane potential. The Bcl-2 expression level induced by different concentrations of PE was lower than that in control groups. However, the Bax expression level induced by PE was higher than that in the control group. Meanwhile, PE increased the caspase-3 expression in a dose- and time-dependent manner. CONCLUSION： Exogenous PE induces apoptosis of human hepatoma HepG2 cells via the bcl-2/bax pathway.     

小干扰RNA沉默脂肪酸合酶基因对人肝细胞株HepG2脂代谢的影响

目的:研究基因干扰技术沉默脂肪酸合酶(FAS)基因后对人肝细胞株HepG2细胞内外脂质含量及脂代谢相关基因表达的影响。方法:合成3对针对FAS mRNA不同位点序列的小干扰RNA(siRNA),分别转染至人肝细胞株HepG 2,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测空白对照组(HepG2细胞不经过任何处理)、阴性对照组(转染没有任何基因干扰作用的阴性siRNA)、FAS-siR NA-1转染组、FAS-siRNA-2转染组和FAS-siRNA-3转染组的FAS mRNA的表达。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测蛋白质的表达水平,筛选出沉默效果最佳的一对siR NA。将最有效siRNA转染至HepG2细胞,48 h后测定细胞内外甘油三酯及总胆固醇含量以及脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果:25 nmol/L si RNA和3μl/孔(24孔板)转染试剂的转染效率最高。FAS-siRNA-3对HepG2的FAS基因的沉默效果最好,FAS-si RNA-3转染组的FAS在mRNA水平和蛋白水平分别降低为空白对照组的(52.33±3.07)%和(51.57±3.14)%。FAS-siRNA-3沉默FAS基因后HepG2的细胞内和细胞外培养液中甘油三酯含量显著低于空白对照组,细胞外总胆固醇含量显著低于空白对照组。与空白对照组比较,FAS-siRNA-3转染组HepG2的肝脂酶基因mRNA表达水平显著升高(P0.0001),微粒体甘油三酯转运蛋白基因mRNA表达水平显著降低(P0.05),差异均有统计学意义。结论:FAS基因沉默可显著降低HepG2细胞内甘油三酯、细胞外培养液甘油三酯和总胆固醇的含量,需进一步的体内外实验加以验证。