转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原

背景:软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用。目的:观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响。方法:包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞。检测骨形态发生蛋白7mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化。结果与结论:转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加。说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸。     

骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。目的:构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。方法:将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组:分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组:以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。结果与结论:转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P<0.05);骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P<0.05)。转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P<0.05);同时,4个指标表达均高于第7天(P<0.05)。病毒转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P<0.05)。提示对骨髓间充质干细胞进行骨形态发生蛋白2腺病毒和骨形态发生蛋白7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用,为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的真核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组),RT-PCR、Northern-Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF-β1调节体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原表达的变化。结果:TGF-β1基因转染软骨细胞后,其Ⅱ型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且随着TGF-β1蛋白表达的丧失,其对软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论:TGF-β1可以上调体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。     

维甲酸对软骨细胞中IGFBP-6基因表达的调控

目的探讨维甲酸对软骨细胞的功能影响及细胞内胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP-6)的表达规律。方法胰酶消化法体外培养兔的软骨细胞;软骨细胞株暴露于1×10-6mol/L全反式维甲酸(ATRA)24 h;细胞免疫化学观察软骨细胞中Ⅱ型胶原的分泌变化;流式细胞仪检测软骨细胞株细胞凋亡率;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析软骨细胞中IGFBP-6 mRNA的表达。结果ATRA抑制了软骨细胞中Ⅱ型胶原的分泌;1×10-6mol/L ATRA使体外培养的软骨细胞的细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);ATRA使软骨细胞中IGFBP-6 mRNA的表达增加了3倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论维甲酸负性调节软骨细胞的分泌和增殖功能,而对软骨细胞中IGFBP-6基因表达具有正性调节作用。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法：全骨髓法＋贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因在兔脂肪干细胞的表达与成骨分化效应

目的:采用腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因转染兔脂肪干细胞,观察目的基因在脂肪干细胞中的表达效率及向成骨细胞定向分化的能力。方法:实验于2005-12/2006-09在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室进行。①实验材料:4月龄健康新西兰大耳白兔2只。质粒pAd-BMP-2由美国哈佛医学院分子骨科中心Oliver博士惠赠;携带β-半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体由李康博士惠赠;大肠杆菌DH5a以及293细胞由本实验室保存。②实验方法:新西兰兔肌注麻醉后,完整取出双侧腹股沟脂肪垫,清除外包膜、明显的结缔组织和小血管,剪碎,离心,体外分离培养脂肪干细胞。表达载体pAd-hBMP-2经293细胞包装重组腺病毒后,取第3代生长良好的脂肪干细胞,按5×105接种于60mm培养皿,将Ad-hBMP-2病毒以感染复数10～20感染细胞。将成功转染骨形态发生蛋白2的脂肪干细胞作为转染组,以转染携带β-半乳糖酐酶基因腺病毒载体的脂肪干细胞作为对照组。两组均置入不含骨形态发生蛋白2的无血清成骨诱导培养基中进行诱导分化。③实验评估:定期观察细胞的形态学变化,MTT法绘制生长曲线,计算增殖时间;成骨诱导培养后测定碱性磷酸酶活性,光倒置显微镜下观察钙化结节形成情况;RT-PCR、免疫组织化学法、Westernblot法检测目的基因人骨形态发生蛋白2和成骨细胞标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的表达。结果:①脂肪干细胞转染前后形态学变化、生长曲线及倍增时间:Ad-hBMP-2基因修饰的脂肪干细胞经诱导培养后形态规则,多角型细胞增多,转染组的细胞生长曲线倍增时间明显短于对照组。②碱性磷酸酶活性及矿化结节形成:转染组脂肪干细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势,成骨诱导培养7,10,14d均显著高于未转染组(P<0.01)。转染组成骨细胞四环素标记显示圆形矿化结节呈金黄色,数量多,结节大。③脂肪干细胞人骨形态发生蛋白2与Ⅰ型胶原、骨钙素的表达:成骨诱导培养7,14d,RT-PCR、免疫组织化学法、Western blot法检测结果显示转染组目的基因人骨形态发生蛋白2、成骨标志性蛋白Ⅰ型胶原、骨钙素的分泌表达均明显强于对照组。结论:经Ad-hBMP-2基因修饰的兔脂肪干细胞在体外能定向分化为成骨细胞,且分化增殖能力强;目的基因骨形态发生蛋白2表达高、持续时间长。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的：研究转化生长因子β(TGF—β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用，为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法：利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的其核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组)，RT—PCR、Nonhem—Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF—β1调节体外培养软骨细胞II型胶原表达的变化。结果：TGF-β1基因转染软骨细胞后，其II型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且随着TGF—β1蛋白表达的丧失，其对软骨细胞II型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论：TGF—β1可以上调体外培养软骨细胞II型胶原的表达。     

维甲酸对软骨细胞中IGFBP-6基因表达的调控

目的 探讨维甲酸对软骨细胞的功能影响及细胞内胰岛素样生长因子结合蛋白6(IGFBP-6)的表达规律.方法胰酶消化法体外培养兔的软骨细胞;软骨细胞株暴露于1×10-6mol/L全反式维甲酸(ATRA)24 h;细胞免疫化学观察软骨细胞中Ⅱ型胶原的分泌变化;流式细胞仪检测软骨细胞株细胞凋亡率;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析软骨细胞中IGFBP-6 mRNA的表达.结果 ATRA抑制了软骨细胞中Ⅱ型胶原的分泌;1×10-6mol/L ATRA使体外培养的软骨细胞的细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P《0.05);ATRA使软骨细胞中IGFBP-6 mRNA的表达增加了3倍,差异有统计学意义(P《0.05).结论维甲酸负性调节软骨细胞的分泌和增殖功能,而对软骨细胞中IGFBP-6基因表达具有正性调节作用.     

人骨形态发生蛋白7基因转染对免髓核细胞增殖和细胞外基质合成的影响

背景：以往的研究表明人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）能够育效促进细胞外基质合成,修复受损的椎间盘基质,恢复椎间盘高度。因此有希望用于摔制和逆转椎间盘退变。然而重组蛋白半衰期每,生物学活性低,退变椎间盘中很难保持骨形态发生蛋白7浓度。基因治疗能够有效预防这砦缺陷。目的：观察人骨形态发生蟹白7基因转染对原代培养的兔髓核细胞生物学活性的影响,为人骨形态发生蛋白7基因治疗椎间盘退变的体内实验研究奠定基础。设计、时间及地点：随机对照,细胞学体外实验。于2005～12／2006—09存解放军第二军医大学长海医院令军胸心外科研究昕实验室完成。材料：4周龄新两兰大耳白兔6只,体质量约500g。Ad-hBMP7由长海医院胸心外科研究所构建,方法：麻醉后处死白兔,提取髓核,依次经过链霉蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和Ⅱ型DNA酶在37℃条件下消化4h,细胞接种于培养皿内,孵箱内培养,7d后每周更换培养液2次。将细胞随机分为3组,用整合有人骨形态发生蛋白7基因的腺病毒感染髓核细胞,整合有Lac-Z基因的腺病毒感染的髓核细胞以及未转染的麓核细胞作为对照组。主要观察指标：以反转录聚合酶链反应和Western-blot的方法在不同水平检测其表达情况,以四甲基偶氮唑盐的方法观察其对细胞增殖能力的影响,以改进的：甲基亚甲蓝色比色法和ELISA法观测人骨形态发牛蛋白7基因转染对细胞合成蛋白多精和Ⅱ型胶原能力的影响。结果：祭定确定人骨形态发生蛋白7基因为止向插入腺病毒裁体,无突变。原代培养的兔髓核细胞形态与文献报道一致。腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白7基因能够高效转染髓核细胞,并表达人骨形态发生蛋白7,同时促进了髓核细胞增殖以及合成蛋白多糖和Ⅱ型忮原,较对照组有显著十牛差异（P〈0．05）。结论：腺病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因具有逆转兔椎间盘退变的能力。     

腺病毒介导骨形态发生蛋S2基因对免软骨细胞的影响

背景：研究证实骨形态发生蛋白2具有促进软骨细胞增殖、分化的能力。目的：进一步验证由腺病毒介导的骨形态发生蛋白2对兔软骨细胞增殖的作用。设计、时间及地点：对比观察，实验于2006-01／2007-12在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料：5．0月龄健康的新西兰白兔4只，体质量3．0～4．0kg，雄雌不限。携带骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体，由苏州大学附属第一医院骨科实验室保存。方法：取兔耳郭的弹性软骨进行细胞培养，再以腺病毒为载体转染骨形态发生蛋白2到软骨细胞内作为实验组，未转染的作为对照组。主要观察指标：采用阿利新蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量测定等方法观察软骨细胞增殖和分化。结果：实验组中的软骨细胞数量多，形态均一，融合率高，酸性黏多糖也较未转染组多。四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量检测结果示实验组均高于未转染组。结论：腺病毒介导的骨形态发生蛋白2能促进软骨细胞增殖、保持软骨细胞的分化表型。     

人骨形态发生蛋白7基因转染对兔髓核细胞增殖和细胞外基质合成的影响

背景:以往的研究表明人骨形态发生蛋白7(hBMP·7)能够有效促进细胞外基质合成,修复受损的椎间盘基质,恢复椎间盘高度.因此有希望用于控制和逆转椎间盘退变.然而重组蛋白半衰期短,生物学活性低,退变椎M盘中很难保持骨形态发生蛋白7浓度.基因治疗能够宵效预防这些缺陷.目的:观察人骨形态发生蛋白7基因转染对原代培养的兔髓核细胞牛物学活性的影响,为人骨形态发生蛋白7基因治疗椎间盘退变的体内实验研究奠定基础.设计、时间及地点:随机对照,细胞学体外实验.于2005-12,2006-09在解放军第二军医大学长海医院全军胸心外科研究所实验室完成.材料:4周龄新西兰大耳白兔6只,体质量约500 g.Ad-hBMP7由长海医院胸心外科研究所构建.方法:麻醉后处死白兔,提取髓核,依次经过链霉蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和儿型DNA酶在37℃条件下消化4 h,细胞接种于培养皿内,孵箱内培养,7 d后每周更换培养液2次.将细胞随机分为3组,用整合有人骨形态发生蛋白7基因的腺病毒感染髓核细胞,整合有Lac-Z基因的腺病毒感染的髓核细胞以及末转染的髓核细胞作为对照组.主要观察指标:以反转录-聚合酶链反应和Western-blot的方法在不同水平检测其表达情况,以四甲基偶氮唑盐的方法观察其对细胞增殖能力的影响,以改进的二甲基亚甲蓝色比色法和ELISA法观测人骨形态发牛蛋白7基因转染对细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力的影响.结果:鉴定确定入骨形态发牛蛋白7基因为正向插入腺病毒载体,无突变.原代培养的兔髓核细胞形态与文献报道一致.腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白7基因能够高效转染髓核细胞,并表达人骨形态发生蛋白7,同时促进了髓核细胞增殖以及合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原,较对照组有显著性差异(P<0.05).结论:腺病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因具有逆转兔椎间盘退变的能力.     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响

背景:透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢?目的:通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法:全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论:经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。     

共培养诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何控制两种细胞间比例以最大效率获得目的细胞是研究中的难题。目的：观察人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞按不同比例共培养后向软骨细胞分化的情况。方法：复苏人脐血间充质干细胞并进行传代,将经流式细胞仪鉴定的人脐血间充质干细胞与体外分离的兔软骨细胞按照2：1或3：1的比例共培养,并用100pg／L的胰岛素样生长因子1进行诱导。在共培养14d,提取细胞RNA和蛋白质,实时定量PCR检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,Westernblot检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果与结论：人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养14d,共培养的细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达高于单纯胰岛素样生长因子1诱导的细胞。在人脐血间充质干细胞与软骨细胞比例相同时,加入胰岛素样生长因子1可提高细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达。同时人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按3：1共培养更能促进细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白及聚集蛋白多糖蛋白的表达;而按2：1共培养时,细胞聚集蛋白多糖mRNA表达更多。可见人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞共培养后可诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化,且按3：1的比例共培养可获得更多的软骨细胞。     

甲状腺素诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化中的作用

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何获得更多的组织工程所需的种子细胞是研究中的难题。目的：探讨不同浓度甲状腺素在人脐血间充质干细胞向兔软骨细胞分化中的作用。方法：将人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按照2∶1比例共培养,并用含有不同浓度甲状腺素(0,0.01,0.1,1,10μmol/L)的培养基分组刺激,共培养14 d后分别观察各组细胞形态,并提取细胞RNA和蛋白质,Real-time PCR检测聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原mRNA表达量,Western blotting技术检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖蛋白表达水平。结果与结论：加入0.01,0.1,1,10μmol/L的甲状腺素干预后,聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均随甲状腺素浓度增加而增强,与单纯共培养组比较差异有显著性意义(P <0.05)。实验证明高浓度甲状腺素可增强人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养后向软骨细胞分化的能力。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因对免软骨细胞的影响

背景: 研究证实骨形态发生蛋白2具有促进软骨细胞增殖、分化的能力.目的: 进一步验证由腺病毒介导的骨形态发生蛋白2对兔软骨细胞增殖的作用.设计、时间及地点: 对比观察,实验于2006-01/2007-12在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成.材料: 5.0月龄健康的新西兰白兔4只,体质量3.0-4.0 kg,雄雌不限.携带骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体,由苏州大学附属第一医院骨科实验室保存.方法: 取兔耳郭的弹性软骨进行细胞培养,再以腺病毒为载体转染骨形态发生蛋白2到软骨细胞内作为实验组,未转染的作为对照组.主要观察指标: 采用阿利新蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量测定等方法观察软骨细胞增殖和分化.结果: 实验组中的软骨细胞数量多,形态均一,融合率高,酸性黏多糖也较未转染组多.四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量检测结果示实验组均高于未转染组.结论: 腺病毒介导的骨形态发生蛋白2能促进软骨细胞增殖、保持软骨细胞的分化表型.     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因对兔软骨细胞的影响

背景:研究证实骨形态发生蛋白2具有促进软骨细胞增殖、分化的能力。目的:进一步验证由腺病毒介导的骨形态发生蛋白2对兔软骨细胞增殖的作用。设计、时间及地点:对比观察,实验于2006-01/2007-12在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。材料:5.0月龄健康的新西兰白兔4只,体质量3.0～4.0kg,雄雌不限。携带骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体,由苏州大学附属第一医院骨科实验室保存。方法:取兔耳郭的弹性软骨进行细胞培养,再以腺病毒为载体转染骨形态发生蛋白2到软骨细胞内作为实验组,未转染的作为对照组。主要观察指标:采用阿利新蓝染色、四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量测定等方法观察软骨细胞增殖和分化。结果:实验组中的软骨细胞数量多,形态均一,融合率高,酸性黏多糖也较未转染组多。四甲基偶氮唑盐比色法和糖胺聚糖定量检测结果示实验组均高于未转染组。结论:腺病毒介导的骨形态发生蛋白2能促进软骨细胞增殖、保持软骨细胞的分化表型。     

重组人骨形态发生蛋白2及制动因素对兔肌腱端重建的影响

背景:骨-肌腱结合结构的重建可能类似于软骨内成骨,只有形成坚固的止点,重建的韧带才能够真正发挥其生理功能.重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)可使未分化间质细胞、成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基质细胞逆转分化为骨系细胞.目的:观察rhBMP-2和制动因素对肌腱止点结构重建的影响.方法:新西兰白兔建立肌腱止点结构重建模型后,随机分成3组.向rhBMP-2短期制动组和rhBMP-2长期制动组实验兔靠近胫骨隧道入口的屈趾总腱内注入重组人骨形态发生蛋白2溶液20 μL,模型组不予注射.术后rhBMP-2短期制动组术肢石膏固定1周后拆除;rhBMP-2长期制动组和模型组兔术肢全程石膏固定.各组分别于手术后2,4,8周通过免疫组化法和RT-PCR测定隧道入口部肌腱中的Ⅰ,Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素的表达.结果与结论:rhBMP-2可使肌腱止点结构重建兔Ⅰ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素表达水平随时间的延长而增加,而Ⅱ型胶原在术后增加至4周时表达至峰值,8周表达有所下降.注射rhBMP-2未对腱重建兔Ⅰ型胶原mRNA表达产生明显变化:而注射rhBMP-2可使Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达显著增加(P<0.05),减少制动时间也能使Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达显著增加(P<0.05).rhBMP-2能促进Ⅰ,Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素的表达,并具有诱导肌腱内异位软骨成骨的作用,使肌腱端结构重建成为可能;长时间制动阻碍肌腱附着点的重建.     

重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在原代培养兔髓核细胞中的表达

目的：研究表明，外源性重组骨形态发生蛋白7具有促进椎间盘细胞增殖以及促进细胞外基质合成的能力，为探讨骨形态发生蛋白7基因疗法治疗椎间盘退变的可行性，本实验拟构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体，并观察其在原代培养的兔椎间盘髓核细胞中的表达情况。 方法：实验于2005—12／2006—06在长海医院胸心外科研究所完成。从整合有人骨形态发生蛋白7全长cDNA的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）－骨形态发生蛋白7中聚合酶链反应扩增骨形态发生蛋白7基因的开放读码框，通过穿梭质粒整合到腺病毒载体pAd－Easy系统上，在293细胞中包装成熟、扩增，酶切鉴定人骨形态发生蛋白7基因整合到该载体中；该载体转染原代培养的兔髓核细胞，并采用反转录－聚合酶链反应和蛋白免疫印迹的方法检测其表达情况。 结果：①实验成功建立了安全、稳定、有效的复制缺陷重组腺病毒Ad－骨形态发生蛋白7的构建方法，经鉴定后证实有骨形态发生蛋白7全长cDNA整合，并且为正向插入。②体外培养的兔原代髓核细胞表现出代谢活性低、增殖能力弱等特点；髓核细胞能够被腺病毒载体高效感染并能够高效表达不同的目的基因，感染效率随感染倍数值的增加而增加；当感染倍数=100时，95％以上的髓核细胞可以被感染，且细胞毒性较小，为最佳感染倍数。③采用最佳感染倍数转染髓核细胞后骨形态发生蛋白7基因在转染后3d就开始表达，并可以持续表达3周以上，几乎所有髓核细胞都可以表达骨形态发生蛋白7。 结论：腺病毒载体可以作为进行骨形态发生蛋白7基因治疗椎间盘退变研究的有效载体。     

AdrhBMP-2转染兔骨骼肌干细胞体外诱导成骨修复骨缺损的实验

目的:评价腺病毒介导的重组人骨形态发生蛋白(AdrhBMP-2)基因对兔骨骼肌干细胞(skeletalmusclestemcells,SMSCs)体外成骨活性的影响,为临床应用于修复骨缺损提供实验依据。方法:实验于2002-04/07在解放军总医院骨科研究所完成。腺病毒介导的基因转染和检测:在293细胞内扩增AdrhBMP-2及AdGFP,并用空斑形成实验测定滴度。实验分为3组:AdrhBMP-2转染细胞组,AdGFP转染细胞组,未转染细胞组。从兔后肢股部骨骼肌内分离培养的干细胞经腺病毒转染后(MOI=50)观察转染率和转染后细胞生物学的变化。腺病毒编码的rhBMP-2基因转染SMSCs后检测重组人骨形态发生蛋白(rhBMP)-2、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达及钙结节的形成。结果:①腺病毒基因转染率为79%;SMSCs转染基因后3d增殖减慢,然后缓慢上升,7d进入增殖平缓期。②转染后第5天,免疫组化染色显示AdrhBMP-2转染细胞组rhBMP-2阳性、ALP阳性、Ⅰ型胶原阳性,细胞转染AdGFP组和未转染细胞组上述指标染色呈弱阳性。③AdrhBMP-2转染细胞后1-3d即开始表达rhBMP-2,13～15d达高峰,19～21d表达量明显减少。④AdrhBMP-2转染后第5天,ALP分泌量及骨钙素含量明显高于其他两组,差异有显著性意义(P<0.05)。⑤AdrhBMP-2转染后第21天染色显示钙结节,其