脂质体介导pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞复合冻干骨的体内成骨和血管化

背景:以往的研究表明血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可以促进移植物的存活和体内生长。目的:观察脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染骨髓基质干细胞后复合冻干松质骨在体内的成骨和血管化效果。方法:取同种异体新西兰大白兔的耾骨和股骨制备冻干骨,用脂质体将血管内皮生长因子转染入体外培养扩增新西兰大白兔骨髓基质干细胞中,使其附着于同种异体冻干松质骨。将新西兰大白兔分为3组,于兔竖脊肌分别植入单纯冻干骨、单纯骨髓间充质干细胞复合冻干骨组、转染有血管内皮生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨。结果与结论:植入后8周时可见到转染血管内皮细胞生长因子的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨标本的表面有软骨和骨质形成,有成骨和破骨细胞出现,并形成类骨质,在移植骨周围组织中有大量血管形成,其他两组仅有大量纤维包裹。说明,脂质体介导的pcDNA3/hVEGF165转染后骨髓基质干细胞复合冻干骨具有较好成骨活性,优于单纯骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和单纯冻干骨。     

冻干骨松质与转染有血管内皮细胞生长因子的骨髓基质干细胞体内成骨实验

目的：探讨冻干骨松质与转染有血管内皮细胞生长因子(VEGF）的骨髓基质干细胞(BMSC)能否在体内更有效地成骨。方法：采用新西兰大白兔BMSC体外培养扩增，然后用脂质体的方法将VEGF转染入该BMSC，再使其附着于同种异体冻干骨松质，并植入自体肌袋，8周后取标本进行苏木精-伊红染色、三色法染色观察。结果：8周时可见到转染有VEGF的BMSC复合冻干骨松质组在标本的表面有软骨和骨质形成，BMSC复合冻干骨松质组在标本的表面有成骨细胞破骨细胞出现，并有类骨质形成，而单纯植入冻干骨松质组仅有大量纤维包裹。结论：转染有VEGF的BMSC复合冻干骨松质具有较好成骨活性，优于单纯BMSC复合冻干骨松质。     

冻干骨松质与转染有血管内皮细胞生长因子的骨髓基质干细胞体内成骨实验

目的:探讨冻干骨松质与转染有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的骨髓基质干细胞(BMSC)能否在体内更有效地成骨。方法:采用新西兰大白兔BMSC体外培养扩增,然后用脂质体的方法将VEGF转染入该BMSC,再使其附着于同种异体冻干骨松质,并植入自体肌袋。8周后取标本进行苏木精-伊红染色、三色法染色观察。结果:8周时可见到转染有VEGF的BMSC复合冻干骨松质组在标本的表面有软骨和骨质形成,BMSC复合冻干骨松质组在标本的表面有成骨细胞、破骨细胞出现,并有类骨质形成,而单纯植入冻干骨松质组仅有大量纤维包裹。结论:转染有VEGF的BMSC复合冻干骨松质具有较好成骨活性,优于单纯BMSC复合冻干骨松质。     

骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染小鼠骨髓基质干细胞的体内诱导成骨

目的：观察骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子。双基因转染的小鼠骨髓基质干细胞是否具有异位诱导成骨能力。方法：脂质体介导下将pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞，用RT-PCR和免疫组织化学法观察骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达：将转染双基因的小鼠骨髓基质干细胞植入裸鼠大腿后群肌袋内，4周后用影像学和组织学方法观察体内诱导成骨效果。结果：转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞扩增出1．2kb及590bp两条带，胞浆中有棕黄色颗粒阳性信号。该细胞植入裸鼠大腿后群肌袋4周后有大量异位骨形成。结论：转染骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因的小鼠骨髓基质干细胞具有较强诱导异位成骨能力。     

骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子_(165)双基因转染小鼠骨髄基质干细胞的体内诱导成骨

目的:观察骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子165双基因转染的小鼠骨髄基质干细胞是否具有异位诱导成骨能力。方法:脂质体介导下将pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髄基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学法观察骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因在小鼠骨髄基质干细胞内的表达;将转染双基因的小鼠骨髄基质干细胞植入裸鼠大腿后群肌袋内,4周后用影像学和组织学方法观察体内诱导成骨效果。结果:转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髄基质干细胞扩增出1.2kb及590bp两条带,胞浆中有棕黄色颗粒阳性信号。该细胞植入裸鼠大腿后群肌袋4周后有大量异位骨形成。结论:转染骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因的小鼠骨髄基质干细胞具有较强诱导异位成骨能力。     

同种异体骨髓基质细胞修复大鼠股骨缺损

目的：评估腺病毒介导的转BMP-2基因的同种异体骨髓基质干细胞的成骨潜能和免疫原性，探索骨缺损修复新途径。方法：将编码骨髓基质干细胞的基因，通过腺病毒介导转染同种异体骨髓基质干细胞后复合藻酸钙凝胶植入骨缺损部位并应用免疫抑制剂FK506。结果：术后8周检查，Adv—hBMP-2转染的同系骨髓基质干细胞-藻酸钙复合体组、Adv—hBMP-2转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙-FK506复合体组以板层骨为主；Adv—hBMP-2转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙复合体组以编织骨和类骨质为主，内有炎症细胞浸润；Adv-βgal转染的同系骨髓基质干细胞一藻酸钙复合体组、Adv-βgal转染的同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙-FK506复合体组、Adv-βgal转染的同种异体骨髓基质干细胞一藻酸钙复合体组无明显新骨形成．缺损区内为纤维结缔组织。结论：Adv—hBMP-2转染同种异体骨髓基质干细胞-藻酸钙一-FK506复合体可促进长骨干节段性骨缺损的修复。     

带部分松质骨小牛皮质骨支架复合兔骨髓间充质干细胞植入兔体内血管内皮细胞生长因子的表达

背景:目前异种松质骨作为组织工程材料较为多见,而皮质骨因其难以降解,孔隙率低等原因限制了其使用.但皮质骨具有许多松质骨不具备的优越性,如生物力学方面,如何开发利用皮质骨是课题研究的重点.目的:观察兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨小牛皮质骨支架材料植入兔体内后血管内皮细胞生长因子表达.方法:健康1月龄新西兰大白兔4只用于干细胞提取;3月龄新西兰大白兔60只,在髂骨翼分别植入骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合异种骨,单纯异种骨,自体髂骨.术后4,8,12,24周取材RT-PCR检测血管内皮细胞生长因子的表达.结果与结论:血管内皮细胞生长因子的表达情况:在各时间点,单纯异种骨组低于骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合异种骨组和自体髂骨组(P < 0.05).术后第4周时,骨髓间充质干细胞成骨诱导后复合异种骨组低于自体髂骨组(P < 0.05),在术后第8,12,24周时,两组差异无显著性意义(P > 0.05).提示兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨支架材料植入新西兰兔体内具有较好的血管生成能力.     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

血管内皮生长因子对珊瑚人工骨材料成骨作用的影响

背景：人工骨材料在大块骨缺损中常常无法发挥成骨作用,研究表明如果存在血供不足,骨缺损难以愈合。目的：了解血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）质粒转染细胞对珊瑚人工骨材料成骨作用的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2004-08/2007-06在德国海德堡大学附属骨科医院实验室完成。材料：应用6～9月龄雌性新西兰白兔24只制备桡骨骨缺损模型,并随机分为4组;自兔的骨髓分离培养骨髓基质干细胞,传代培养扩增;通过EndoFree Plasmid Giga试剂盒扩增pVEGF165和pCR3.1的质粒。方法：将pVEGF165或pCR3.1质粒转染骨髓基质干细胞,将含有VEGF基因的质粒和VEGF基因重组的骨髓基质干细胞分别载入珊瑚人工骨材料,然后植入2组模型兔桡骨干中段15mm的骨缺损内,另外2组植入载空白质粒或空白质粒转染的骨髓基质干细胞的珊瑚人工骨材料。主要观察指标：实验动物桡骨骨缺损内人工骨材料吸收速度,血管数目以及新形成的骨量。结果：VEGF重组的骨髓基质干细胞分泌足量VEGF超过1周;血管计数发现VEGF质粒和骨髓基质干细胞能促进血管生成,但体外转染VEGF的细胞疗效更显著;VEGF质粒或其转染的骨髓基质干细胞对珊瑚人工骨材料的吸收具有促进作用。结论：VEGF基因重组的细胞能够持续表达高于正常水平的VEGF,并且能够在一定程度上促进人工骨材料的吸收。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

转染血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠足背创面

背景：糖尿病足溃疡严重威胁患者的健康甚至生命,其治疗仍是国际性难题,目前缺乏良好有效的治疗手段,而基因疗法和干细胞疗法在创伤修复领域展现出独特的优势和潜力。目的：探索转染人血管内皮生长因子165（human vascular endothelial growth factor 165, hVEGF165）基因的骨髓间充质干细胞对大鼠糖尿病足背创面的治疗效果。方法：体外构建hVEGF165基因的腺病毒表达载体,转染第3代大鼠骨髓间充质干细胞;将120只雄性Wistar大鼠分成正常溃疡对照组、模型组、基因治疗组、干细胞治疗组和基因转染干细胞治疗组。后4组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病,在所有大鼠的后足背切取一3 mm×7 mm矩形全层皮肤制成足背创面模型。各组大鼠均在足背创缘皮下分点注射移植,距创缘5 mm处、等距6点,正常溃疡对照组和模型组各点均注射50μL的PBS,基因治疗组各点注射50μL的腺病毒悬液（1×1013 pfu/L）,干细胞治疗组各点注射50μL的干细胞悬液（1×1010 L-1）,基因转染干细胞治疗组各点注射50μL的病毒转染后的干细胞悬液（1×1010 L-1）。结果与结论：与模型组、基因治疗组、干细胞治疗组相比,基因转染干细胞治疗组大鼠创面愈合率、血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平、局部毛细血管数量均有显著提高（P〈0.05）,但较正常溃疡对照组差（P〈0.05）。说明 hVEGF165基因联合骨髓间充质干细胞疗法能够促进大鼠糖尿病足背创面的愈合,其主要机制为促进局部血管的生成及血管内皮生长因子的表达。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景：小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。目的：观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。方法：制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。结果与结论：实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组（P〈0.01）,且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

人工骨联合骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死

背景：骨髓间充质干细胞具有自我增殖能力和分化多潜能性,β-磷酸三钙陶瓷人工骨具有良好的细胞亲和力及良好的生物相容性,是治疗股骨头坏死的热点。目的：观察骨髓间充质干细胞联合β-磷酸三钙对兔股骨头坏死的修复作用。方法：抽取兔自体骨髓并分离和培养骨髓间充质干细胞,扩增至3代后与β-磷酸三钙复合;24只兔建立双侧股骨头坏死动物模型,48侧股骨头随机分为3组,空白组制作缺损而不填充任何材料;β-磷酸三钙组单纯填充β-磷酸三钙;复合组填充β-磷酸三钙和骨髓间充质干细胞的复合材料。结果与结论：修复后8周复合组成骨细胞较多,新生骨小梁相互连接成片;β-磷酸三钙组骨量少,部分纤维组织填充;空白组缺损区靠近宿主骨区域可见少许软骨细胞及软骨组织,纤维组织较多。修复后4,8周复合组骨缺损平均阻射密度较β-磷酸三钙组、空白组增高（P〈0.05）;β-磷酸三钙组与空白组相比差异无显著性意义（P〉0.05）。采用Lane-Sandhu法评分标准,4,8周复合组骨小梁面积均高于β-磷酸三钙组及空白组（P〈0.05）。提示骨髓间充质干细胞有较强的成骨作用,有助于股骨头坏死缺损的修复。     

重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞条件的优化

背景：血管内皮生长因子能够提高骨细胞的增殖能力,促进骨折局部血管发生,在骨缺损修复过程中发挥着至关重要的作用。目的：优化重组真核质粒pEGFP/hVEGF165转染兔成骨细胞的条件,为构建新型组织工程骨种子细胞提供实验基础。方法：体外分离、培养并鉴定兔成骨细胞。分别应用0.8,1.0,1.2μg的质粒和1.5,2.0,2.5,3.0μL脂质体两两组合,通过脂质体法将重组真核表达质粒pEGFP/hVEGF165转染入兔成骨细胞,转染48h后倒置荧光显微镜下观察并测定转染率。结果与结论：随着脂质体剂量的增加,成骨细胞死亡增多。转染48h后,倒置荧光显微镜下可见细胞质内发绿色荧光的小颗粒成弥散分布,或在核周浓集成块状。其中,脂质体2.5μL和质粒1.2μg条件下的转染率最高,可达56%。说明质粒与脂质体之间的交互作用能够显著影响转染率,脂质体2.5μL和质粒1.2μg是转染兔成骨细胞的最佳条件。