脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向成骨细胞的分化潜能。方法从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;1.0×10-8mol/L地塞米松,2.0×10-4mol/L抗坏血酸,7.0×10-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,von-Kossa染色鉴定。结果成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后细胞间可见黑色矿化物沉积阳性。结论脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为成骨细胞。     

重型肝病患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18

背景:脐血富含间充质干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:观察肝衰竭患者血清对人脐血间充质干细胞的诱导分化作用。方法:密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离纯化脐血间充质干细胞并鉴定,以20%肝衰竭患者血清诱导培养,培养7,14,21d采用免疫组织化学方法检测白蛋白和细胞角蛋白18的表达。结果与结论:实验分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,人脐血间充质干细胞高表达CD44和CD29,不表达CD34,体外可以分化为脂肪细胞;人脐血间充质干细胞在肝病患者血清的低糖DMEM培养基中形态发生明显改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,SP染色显示实验组培养7d时仅少数细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18,培养14,21d,白蛋白和细胞角蛋白18表达阳性率逐渐升高,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)。提示密度梯度离心和贴壁培养法相结合可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,肝衰竭患者血清可诱导间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化

背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景.但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一.目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力.方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定.结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形.经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性.     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景:脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点.目的:体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 06/2009 01在青岛大学医学院试验室完成.材料:脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供.方法:采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代.取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%～60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况.结果;原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列.第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34.生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期.胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛.第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性.结论:采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞.     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。材料：胎龄37～40周的新生儿脐血。方法：以Ficoll-HyPfdque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基＋体积分数0．1胎牛血清或Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论：使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

脐血混合培养纯化人间充质干细胞及生物学特性研究

目的探讨体外分离、混合培养纯化人脐血间充质干细胞的适宜体系,观察该人脐血间充质干细胞生物学特性。方法收集孕足月新生儿脐血,每3份脐血[(70—100)ml/份]混合;采用1.077 g/ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)以1 500 r/min密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,在Mesencult培养基中贴壁培养筛选人脐血间充质干细胞,显微镜下观察细胞生长形态变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞抗原表达,分析细胞周期;体外诱导脐血间充质干细胞成脂、成骨分化。结果密度梯度离心法所获得的单个核细胞,在培养基中培养约3—5 h开始出现贴壁生长,24 h后贴壁细胞增多,呈明显纺锤状,10 d后开始出现细胞克隆,3周后呈漩涡状生长。原代培养时间为15 d,P1代倍增时间为26 h。流式细胞仪鉴定:贴壁生长的细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45。分化潜能鉴定体外培养细胞可以成脂、成骨分化。结论所贴壁培养出的细胞的生长形态、流式表形、分化潜能具有人脐血间充质干细胞生物学特征,混合培养可以提高间充质干细胞培养成功率,实验中采用的培养体系适宜人脐血间充质干细胞的分离培养。     

人软骨细胞培养上清诱导脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：人脐血间充质干细胞作为软骨缺损修复的种子细胞日益受到关注,现有常用诱导方法无论是应用诱导培养基还是诱导因子,因其价格昂贵、用量大等因素限制了实际应用。
　　目的：验证人软骨细胞培养上清诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化的可行性。
　　方法：利用密度梯度离心法和贴壁培养法分离新生儿脐血,获取并培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。切取股骨头置换或全髋关节置换患者透明软骨组织,体外分离培养软骨细胞,利用其培养上清培养人脐血间充质干细胞,培养2周后观察细胞表型外观变化,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原表达结果。
　　结果与结论：密度梯度离心法与贴壁培养法可以分离获取人脐血间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标记CD90,CD105高表达,不表达CD34,CD45。软骨细胞培养上清诱导2周后,人脐血间充质干细胞向多角形、圆形转变,Ⅱ型胶原免疫组化检测表达阳性。提示软骨细胞培养上清可诱导人脐血间充质干细胞表达Ⅱ型胶原,向软骨细胞分化。     

两性霉素B处理人脐带间充质干细胞的培养与分化

背景：建立和完善避免真菌污染的方法,有效降低采集脐带时分离培养的污染率,以便获得优质高效的脐带间充质干细胞。目的：探讨两性霉素B对脐带间充质干细胞的生长状态及分化潜能的影响。方法：采用胶原酶消化法从正常顺产足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞,经两性霉素 B 处理,用MesenPRO RS？培养基进行体外扩增培养。取对数生长期的第3代脐带间充质干细胞,分析其形态、增殖方式和免疫表型,在体外诱导其向成骨和脂肪细胞分化。结果与结论：经两性霉素B处理后,在体外仍能成功分离培养出脐带间充质干细胞。流式细胞术结果显示,人脐带间充质干细胞仍强表达CD44,CD105,CD73,CD90,阴性表达HLA-DR,CD29,CD31,CD34。两性霉素B处理后的人脐带间充质干细胞经体外诱导能向脂肪和成骨细胞分化。     

慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达

背景：近年来研究证明间充质干细胞具有高度增殖和多向分化潜能,是一种理想的组织工程种子细胞,能高效转染表达外源性目的基因,在基因治疗领域具有广阔的应用前景。目的：将含有NEP1-40基因的慢病毒载体转染脐血间充质干细胞,评价基因转染后脐血间充质干细胞生物学功能变化,观察NEP1-40在脐血间充质干细胞中的表达。方法：体外分离和培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记,并对其生物学特性进行鉴定。同时将NEP1-40基因克隆入慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染脐血间充质干细胞。结果与结论：实验通过密度梯度离心法成功在体外分离和培养脐血间充质干细胞,诱导其向脂肪细胞分化,流式细胞仪检测结果显示脐血间充质干细胞中CD90、CD73及CD105蛋白阳性,不表达CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白;real-timePCR检测发现其NEP1-40mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,NEP1-40的表达量越高,此外转染NEP1-40后的脐血间充质干细胞中可检测到NEP1-40蛋白,提示NEP1-40基因转染后脐血间充质干细胞原有的生物学功能无明显影响。     

地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化

背景：在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的共同作用下,人脐带间充质干细胞可以向成骨细胞分化。作为糖皮质类激素的地塞米松,其浓度对人脐带间充质干细胞体外成骨分化存在着影响。目的：探寻人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中地塞米松的优选浓度。方法：采用植块法从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞。取第3代细胞进行日常细胞培养和诱导分化实验。流式细胞术检测所获细胞的表面标记表达情况,成脂、成骨诱导分化鉴定人脐带间充质干细胞。倒置相差显微镜观察成骨分化过程中细胞形态的变化。以含1×10^-8mol／L,5×10^-8mol／L,1×10^-7mol／L3种浓度地塞米松的成骨诱导液对人脐带间充质干细胞进行成骨诱导。盐酸四环素荧光及VonKossa染色法对比观察钙结节形成。反转录一聚合酶链反应法对比检测细胞骨桥蛋白基因表达。结果与结论：植块法分离的人脐带间充质干细胞形态均一,多为梭形,平行排列生长或旋涡状生长。流式细胞术检测CD29,CD73和CD90呈阳性表达,CD31,CD34和HLA-DR呈阴性表达。成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O染色呈阳性。盐酸四环素荧光结果和VonKossa染色结果显示,所形成的钙结节大小及数量,均随着地塞米松浓度的增加而增强、增多。反转录一聚合酶链反应检测结果显示,3种浓度地塞米松组的骨桥蛋白基因均有表达,且表达强度随着地塞米松浓度的增加而增强。提示成骨诱导液中地塞米松浓度为1×10^-7mol／L时,能更有效地诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化。     

人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后心肌特异性肌钙蛋白I的表达

背景：人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,经诱导后是否可向心肌细胞分化？目前的报道尚不多。目的：观察人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后肌钙蛋白I的表达情况。方法：取第2代人脐带间充质干细胞标本,经消化、离心、沉淀后,分为7份,制成细胞悬液,调整细胞浓度为2×10^7L^-1,分别加入浓度为80,40,20,10,5,2．5,0μmol／L5-氮胞苷于同样条件继续培养,作用24h后除去,继续培养4周。结果与结论：①人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷处理24h之后,各组细胞都会出现部分死亡,失去典型的梭形形态,成为棍状或者柱状,40,80μmol／L组细胞形态变化明显。②免疫组化染色显示5,10,20,40,80μmol／L组诱导后2周心肌特异性肌钙蛋白I表达呈阳性,对照组与2．5μmol／L组心肌特异性肌钙蛋白I表达为阴性。选取5个高倍视野进行细胞计数,80,40,20,10μmol／L组间心肌样细胞的转化率差异无显著性意义,均明显高于5μmol／L组（P〈0．05）。⑨超微结构观察显示经5-氮胞苷诱导后4周时部分人脐带间充质干细胞内可见典型的肌小节及心房颗粒。而未经5-氮胞苷诱导的对照组无以上改变。结果提示经5-氮胞苷诱导后人脐带间充质干细胞能够向心肌样细胞转化。     

用于造血干细胞移植的人骨髓间充质干细胞体外扩增研究

本研究旨在检查4种不同培养液体外培养人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）的效果，建立一种基于临床移植需要的分离、培养人BM-MSC的方法，为BM-MSC联合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础。采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离BM—MSC，分别用含10％脐带血血清、胎牛血清、成人血清的DMEM／F12培养液和MesenCuh培养液培养，用流式细胞术检测细胞表面抗原，以成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组BM-MSC定向分化，通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定。结果表明：4种培养液都能从成人骨髓液中分离培养出BM—MSC，脐带血血清组和Mesen Cuh组培养的BM—MSC在增殖数量和速度上相似，但均优于FCS组和AB型血清组。脐带血血清组和Mesen Cuh组培养的BM-MSC表达CD29、CD73、CD105的阳性率比FCS组和AB型血清组高（P〈0．05），而CD31阳性率低于FCS组和AB型血清组（P〈0．05），脐带血血清组和MesenCuh组培养的BM—MSC诱导为成骨细胞和脂肪细胞阳性率高于FCS组和AB型血清组（P〈0．05）。结论：4种不同培养液能够从成人骨髓液中分离出BM—MSC，脐带血血清组和MesenCuh组培养的BM-MSC的纯度和体外诱导分化能力比FCS组和AB型血清组高，含有脐带血血清的培养体系具有临床应用价值。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点.目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供.方法:采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验.流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化.通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定.主要观察指标:①细胞形态.②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期.③表面标志物的鉴定.④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况.结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P＜0.05).两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P＜0.05).②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P＜0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P＜0.05).③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P＜0.05).结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用.     

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化

背景：脐带间充质干细胞取材方便、无创,不受伦理学限制,比一般干细胞原始,免疫原性小,其应用前景广阔,是一种理想的种子细胞。 目的：分离鉴定脐带间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞和成脂细胞分化。 方法：组织块贴壁法分离纯化脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,观察细胞形态、生长方式;流式细胞仪检测干细胞表型CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况,并在体外检测能否将其诱导分化为成脂细胞及成骨细胞。 结果与结论：用组织块法成功分离培养出脐带间充质干细胞,流式细胞学鉴定显示细胞强表达 CD90和CD105,不表达 CD34和 CD45;能在体外将其成功诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果显示组织块贴壁法能够从人脐带中分离出间充质干细胞,该细胞可向成脂细胞及成骨细胞分化。     

肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景：成纤维生长因子可促进间充质干细胞增殖、贴壁生长,但对其诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验报道为数不多。当肝细胞生长因子质量浓度达1μg／L时,可促进肝细胞有丝分裂,它是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂。 目的：体外分离培养人脐带间充质干细胞,拟揭示其生物学特性及在细胞因子联合诱导下向肝样细胞分化的能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008—08／2009-04在暨南大学血研所完成。 材料：脐带取自健康足月胎儿,产妇对实验知情同意,由广州华侨医院提供。肝细胞生长因子、成纤维生长因子为美国Peprotech产品。 方法：Ⅳ型胶原酶消化＋差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,取传至第3代细胞,进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定,检测其成脂、成骨能力。取第5代细胞,调整细胞密度为5×10^9L^-1,分为2组：对照组用含体积分数为5％胎牛血清的DMEM／F12培养液培养：诱导组在其基础上,添加20μg／L肝细胞生长因子、10μg／L成纤维生长因子联合诱导其向肝样细胞分化。 主要观察指标：人脐带间充质干细胞的生物学特性,人脐带间充质干细胞体外向肝样细胞的分化情况。 结果：成功从人脐带中分离并纯化得到间充质干细胞,第3代细胞92．2％处在G0/G1期：表达CD29,CD44,CD105,不表达造血细胞标志CD34,CD45．油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,碱性磷酸酶染色后细胞质呈黑色,具有成脂、成骨能力。经肝细胞生长因子、成纤维生长因子联合诱导10d后,RT-PCR及Western blot检测结果显示细胞表达肝细胞特异性抗原甲胎蛋白、白蛋白,对照组均呈阴性表达。 结论：人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化。