影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景:脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法.目的:探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素.方法:分别从不同胎龄(≥40周,37周和≤32周),脐血中单个核细胞数量(≥2.5× 109 L-1,< 2.5×109 L-1),不同细胞接种浓度(1×107,1×109,1×1011 L-1),不同体积分数胎牛血清(5%,10%,15%,20%)以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较.结果与结论:脐血间充质干细胞的分离培养成功率为58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低(P < 0.01);脐血中单个核细胞浓度≥2.5×109 L-1组培养成功率高于< 2.5×109 L-1组(P < 0.01);相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关(r = -0.95,P < 0.01);1×1011 L-1组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于1×107,1×109 L-1;体积分数5%FBS组间充质干细胞贴壁速度较其他3组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他3组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组.提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响:通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系.     

脐血间充质干细胞培养体系的建立

目的:寻找脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。方法:实验于2005-06/2006-04在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。脐带血36份,50～60mL/份,取自青岛大学医学院附属医院产科健康产妇正常足月顺产或剖宫产分娩婴儿的脐带血,经产妇本人及家属同意。无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。16份脐血每份分为3组,分别以间充质干细胞接种密度1×107L-1、1×109L-1、1×1011L-1接种于未包被6孔培养板内,加入5%胎牛血清的DMEM-LG培养。20份脐血每份分为3组,以1×1011L-1单个核细胞密度分别加入5%、10%和20%胎牛血清的DMEM-LG接种于胎牛血清包被的6孔培养板内培养。采用常规的间充质干细胞培养Friedenstein法进行脐血间充质干细胞的培养和扩增培养。观察不同脐血单个核细胞的接种密度、培养液胎牛血清浓度和胎牛血清包被培养皿对间充质干细胞培养的影响。结果:①胎牛血清未包被组以1×107L-1和1×109L-1接种组培养7d后贴壁数量很少,贴壁的细胞未长满瓶底即死亡,无法传代。1×1011L-1组贴壁细胞较多,间充质样细胞与破骨样细胞并存。1×1011L-1组分5%、10%、20%3种血清浓度,贴壁细胞均较多,以间充质干细胞为主,胎牛血清浓度5%组间充质干细胞的纯度较10%及20%组高,破骨样细胞相对较少;胎牛血清包被组与未包被组相比,贴壁细胞少,培养的间充质干细胞纯度较高,破骨样细胞相对较少。②流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,脐血P3代间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD45、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论:将脐血单个核细胞以1×1011L-1高密度接种在5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞,其培养成功率和间充质干细胞纯度较高。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点,但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法.目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法.方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血,随机分为5组：低糖DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组.用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中,放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原.结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）,细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）.②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3,6,9,12,15,18,21天低糖 DMEM＋干细胞因子组、低糖 DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P 〈0.05）.低糖DMEM＋干细胞因子组与低糖DMEM ＋骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义.结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用.     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景:在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢?目的:比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法:取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法(A组)、密度梯度离心分离法(B组)、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法(C组)、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法(D组)分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论:36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份(27%)培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或(和)圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的:观察不同条件对人脐血间充质干细胞培养的影响。方法:实验于2004-10/2005-10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞,经椎虫蓝染色进行活细胞计数,比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1×109L-1,2×109L-1,5×109L-1接种单个核细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液(含体积分数0.1的胎牛血清)培养单个核细胞,其他条件相同,从72h后对所形成的细胞克隆进行计数,对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果:①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态:用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血(P<0.05)。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×109L-1密度接种,72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆,在10d后出现梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况:在10d以后,用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞,有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5×109L-1细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持,对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。材料：胎龄37～40周的新生儿脐血。方法：以Ficoll-HyPfdque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基＋体积分数0．1胎牛血清或Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论：使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

脐血间充质干细胞体外培养方法的改良及其成骨分化能力

目的:采用两种改良方法体外分离培养脐血间充质干细胞,并观察其成骨分化能力。方法:实验于2006-05/09在上海交通大学医学院附属第九人民医院骨与关节中心细胞实验室完成。①所用28份脐血标本由复旦大学医学院附属妇产科医院提供,取自足月健康顺产新生儿,产妇和家属均书面同意,实验经医学伦理委员会批准。②采集28份脐血标本,50～90mL/份,枸橼酸抗凝。采集后12h内密度梯度离心法分离出单个核细胞,接种于100mm×20mm培养皿中,细胞浓度为1×1010L-1,置于含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养液中原代培养,5～7d后半量换液,后每隔3～4d全量换液一次。③细胞贴壁后,分两组予以改良培养。改良1组10份,当培养皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的培养皿中培养;改良2组18份,待培养皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基更换为含体积分数为0.15小牛血清的α-MEM,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基。成纤维样细胞融合至80%～90%时胰酶消化,按1∶2或1∶3传代培养。④显微镜下观察脐血间充质干细胞的形态。取第5代脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪测定细胞免疫表型,以碱性磷酸酶法检测成骨分化能力。结果:①28份脐血间充质干细胞中,共20份原代培养中出现贴壁细胞(改良1组6份,改良2组14份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率46.4%。②原代培养5～7d后贴壁细胞呈梭形成纤维样细胞和圆形巨核细胞。改良1组与2组于原代培养5周可见成纤维样细胞集落,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,传至22代形态无明显变化。③可强烈表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志,而不表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志。④成骨诱导1周,脐血间充质干细胞可分化为成骨细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性。结论:脐血中存在的单个核细胞经过改良培养后,可提高脐血间充质干细胞的培养成功率。脐血间充质干细胞具有与其他来源的单个核细胞类似的表型及成骨分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景:目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/4,牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少.目的:观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响.方法:用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定.结果与结论:脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖.流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变.     

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖.实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果.方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成.①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4-5代细胞用于实验.密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109 L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞.脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108 L-1组,各100 μL接种于96孔培养板,加入2×108 L-1 T淋巴细胞悬液100 μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化.以T淋巴细胞 植物血凝素为阳性对照.③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达.MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响.结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18 d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7 d左右细胞达90%融合.流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45.②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P＜0.01).间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%.结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性.     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析

背景：目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法。目的：对传统的体外分离培养脐带血间充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-04／2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。材料：取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意。方法：无菌条件下取新生儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10％胎生血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5-7d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次。待细胞贴壁后,按处理方法不周分为2组：改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养;改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15％小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10％胎牛血清的α-MEM培养基。取第5代脐带血间充质干细胞,逍行体外成骨及成脂诱导。主要观察指标：显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测细胞诱导分化能力。结果：28份脐带血中20份培养出贴壁细胞（改良1组6份/10份,改良2组14份／18份）,其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞（改良1组4份,改良2组9份）,成功率为46.4％,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等间充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等早阴性表达。在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞。结论：脐带血中存在间充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景:相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低.目的:通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成.材料:健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意.方法:无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法(1500 r/min离心15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5 μg,L GM-CSF、15 μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3 d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24 h换液1次.当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型.结果:24 h后可见有少量细胞贴壁,48 h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%～90%呈现融合.第2代细胞接种后12 h开始贴壁,10 d即可达80%～90%融合.流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34.结论:实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原.     

人脐血间充质干细胞的生物学特性及其成骨成脂肪分化（英文）

背景：目前有关脐血间充质干细胞的生物学特性及分化能力的研究较少。目的：观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,及其向成骨、成脂肪细胞分化的能力。方法：从不同胎龄脐血中分离间充质干细胞,对其进行原代和传代培养,并诱导其向成骨及成脂肪细胞分化。结果与结论：倒置相差显微镜下见分离培养的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜下可见脐血间充质干细胞胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强,低胎龄的脐血间充质干细胞集落形成能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD29,CD44和CD90,不表达造血细胞标志CD34和CD45。成骨诱导后3周,碱性磷酸酶染色为强阳性,茜素红染色可见大量钙化基质的形成;成脂诱导3周,油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞具有间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性,可向成骨细胞及脂肪细胞分化。     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析析☆

背景:目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法.目的:对传统的体外分离培养脐带血问充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-04/2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成.材料:取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意.方法:无菌条件下取新牛儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5～7 d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次.待细胞贴壁后,按处理方法不同分为2组:改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养:改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15%小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基.取第5代脐带血间充质干细胞,进行体外成骨及成脂诱导.主要观察指标:显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测绌胞诱导分化能力.结果:28份脐带血中20份培养出贴壁细胞(改良1组6份/10份,改良2组14份/18份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率为46.4%,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等问充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等呈阴性表达.在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞.结论:脐带血中存在问充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率.     

脐带血重建造血潜能的母体及新生儿因素分析

脐带血作为一种备选的移植用造血干细胞,能否成功植入与输入受者体内的总有核细胞（total nucleated cells,TNC）数、CD34＋细胞数及粒-巨噬细胞集落形成单位（colony-forming unit-granulocyte-macrophage,CFU-GM）有关。本研究探讨影响脐带血造血潜能的母体及新生儿因素。按照广州脐血库标准化操作常规（SOP）,对脐带血样本进行筛选、处理、检测及冷冻,回顾性分析已保存的4615份脐带血样本的造血细胞参数及其与母体及新生儿特征的相关性。结果表明：脐带血采集量（Mean±SD：95.23±22.42ml;Median：91.85ml）与处理前TNC[Mean±SD：（1.34±0.49）×109;Median：1.25×109]及处理后TNC[Mean±SD：（1.21±0.42）×109;Median：1.14×109]、CD34＋细胞数[Mean±SD：（5.14±4.55）×106;Median：4.08×106]、CFU-GM[Mean±SD：（9.72±8.66）×105;Median：7.53×105]三者均显著相关（p〈0.001）。在供者因素中,只有婴儿出生体重与脐带血采集量及造血细胞参数均呈显著正相关（p〈0.001）,较大婴儿的脐带血在采集量、TNC、CD34＋细胞数及CFU-GM方面均呈现优势（p〈0.001）。母亲年龄与上述各项参数均无显著相关。孕龄与处理前/后TNC正相关（p〈0.001;p〈0.001）,与CD34＋细胞数呈负相关（p=0.04）,而与采集量及CFU-GM均无显著相关。剖宫产时采集的脐带血量虽然高于阴道分娩（Mean±SD：97.05ml±22.23mlvs.92.53ml±22.43ml;Median：94.08mlvs.88.82ml;p〈0.001）,但各细胞参数均低于阴道分娩（p〈0.001）。男婴脐带血的采集量和CD34＋细胞数高于女婴（Mean±SD：96.41ml±22.31mlvs.93.95ml±22.47ml;Median：93.27mlvs.90.14ml;p〈0.001）;[Mean±SD：（5.28±5.04）×106vs.（5.00±3.94）×106;Median：4.18×106vs.3.94×106;p=0.042]、但处理前TNC及处理后TNC均低于女婴[Mean±SD：（1.31±0.50）×109vs.（1.37±0.47）×109;Median：1.22×109vs.1.28×109;p〈0.001];[Mean±SD：（1.18±0.42）×109vs.（1.24±0.41）×109;Median：1.10×109vs.1.17×109;p〈0.001],二者CFU-GM的差异无统计学意义。结论：本研究数据有助于优化脐带血供者筛选及提高脐血库资源利用率。脐血库应侧重选择体重较大、阴道分娩的新生儿供者,优先处理采集量大、TNC高的脐带血样本。     

脐血间充质干细胞支持下脐血单个核细胞扩增的研究

目的 探讨脐血源间充质干细胞联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用.方法 从脐血中分离、培养出间充质干细胞并检测其细胞表面抗原;以此间充质干细胞作为细胞滋养层.将脐血单个核细胞接种于无血清培养体系中培养18天,在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数、CD34+、CDl33+细胞数、集落形成单位数和(G2+M+S)期细胞含量变化.结果 ①从脐血中分离、培养出的间充质干细胞能稳定表达CD29、CD105和CD44,但不表达CD34和CD133;②外源性细胞因子及脐血源间充质下细胞均支持脐血间充质干细胞扩增,但以细胞因子联合脐血源间充质干细胞组效果最好,在第10天上述榆测指标达到峰值,分别为第0天的(6.91±1.91)、(7.75±1.24)、(6.49±1.33)、(15.62±1.29)和(28.26±6.58)倍,且维持造血至少18天.结论 ①从脐血巾能成功分离、培养出间充质下细胞,并完成细胞表型的初步鉴定;②外源性细胞因子联合脐血源间允质干细胞可有效扩增脐血单个核细胞.     

中药单体黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:抗氧化剂法及细胞因子法是体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元的2种方法,怎样选择既可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,应用中药下预脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增并向神经元细胞分化.目的:观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.设计,时间,地点:随机对照,细胞学体外观察,于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验窒完成.材料:年龄为23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份;黄芩苷,纯度＞95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供:抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.方法:采集胎儿脐带血,肝素抗凝,分离出脐血单个核细胞,调整细胞浓度为1×109L-1,以含体积分数为20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷:空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇;共培养组添加黄芩苷、β-巯基乙醇.连续培养4周.主要观察指标:①脐血冷冻保存后7,14,21,28dCD34及CD29阳性细胞的表达.②细胞形态学观察.③流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志.④免疫细胞化学染色观察间充质干细胞扩增培养4周后神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.结果:①与冻存前相比,冻存后7,14,21,28 d脐血单个核细胞锥虫蓝拒染率均明显降低(P＜0.05).②细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2-3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起.β-巯基乙醇组、共培养组有少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.⑧培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组最多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组最少,组间两两比较差异具有显著性意义(P＜0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34阳性细胞.④扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P＜0.01).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μ mol/L黄芩苷可促进脐血间充质下细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.     

脐血间充质干细胞移植脊髓损伤恢复期患者的免疫功能变化

背景：间充质干细胞移植因其具有一定的免疫原性,对脊髓损伤患者免疫功能的影响尚无深入系统的报道。目的：观察脐血源间充质干细胞移植对脊髓损伤患者免疫功能的影响。方法：61例脊髓损伤患者采用静脉滴注结合腰椎脊髓蛛网膜下腔注射脐血间充质干细胞悬液治疗。应用流式细胞术及免疫比浊法分别测定患者移植前后T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及补体的含量。结果与结论：与治疗前相比,患者CD3＋、IgA及IgG有下降趋势,差异有显著性意义;CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋、IgM、C3及C4均有升高或下降趋势,但差异无显著性意义。提示脐血源间充质干细胞移植对细胞及体液免疫不会激活急性免疫应答,移植是安全的,存在负向免疫调节作用的可能,但尚需进一步完善相关指标,扩大样本,明确相关机制。