大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景:骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论.目的:建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点.方法:采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线.于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色.结果与结论:采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞.对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P<0.05).实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性.说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Vonkossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1．073g／mL的Percoll分离液,3000r／minx30min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2000—2500r／min×（20—30）min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基（对照组）和成骨诱导培养基（实验组）中培养。结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组（P〈0．05）。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

Bio-Gide胶原膜对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

背景：相关实验表明Bio-Gide胶原膜与细胞有良好的生物相容性,但有关与其复合培养干细胞成骨分化能力的报道少见。 目的：观察Bio-Gide胶原膜对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,将第3代兔骨髓间充质干细胞分别接种于覆盖Bio—Gide胶原膜的培养板（实验组）与单纯培养板（对照组）培养。于培养1,4,7,14d利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖;成骨分化诱导培养1,4,7,14d收集细胞培养液上清,检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：两组细胞数量均随着培养时间的增加而不断增加,对照组培养7d细胞数量明显多于实验组（P〈0．05）,其他时间点组间比较差异无显著性意义。两组细胞碱性磷酸酶活性均随着培养时间的增加而不断增加,实验组成骨诱导14d细胞碱性磷酸酶活性高于对照组（P〈0．05）,其他时间点组间比较差异无显著性意义。表明Bio-Gide胶原膜可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

密度梯度离心并贴壁法分离成人骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的:观察密度梯度离心法结合贴壁法体外分离纯化培养人骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的成人骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法:实验于2005-05/09在中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院进行。用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞。采用倒置显微镜观察,噻唑兰法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。取体外扩增的第3代骨髓间充质细胞,以3.0×103/cm2的浓度接种于放置有无菌处理的盖玻片的六孔板中,每孔内加2mL含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基培养液。当细胞贴壁生长达到60%～70%汇合时,将培养基更换为含5%胎牛血清的低糖型DMEM培养液,其中含骨诱导剂地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油,浓度分别为:100nmol/L、0.25mmol/L、10mmol/L。间充质细胞在这样的诱导体系中进行诱导培养,对照只加培养基。在第4、8、12、16天分别观察各孔中细胞的形态学和组织化学变化。体外加成骨诱导剂后分别作碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色和VonKossa染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化结果。结果:①分离的骨髓间充质干细胞培养48h后贴壁,72h后出现纺锤状细胞,贴壁的骨髓间充质细胞平均约12d后形成克隆。②第2代骨髓间充质干细胞99%表现为CD44 、Vim 、CD34-,CD29-。细胞表型稳定。③加成骨诱导剂后碱性磷酸酶活性明显增高,钙沉积在第8d就开始出现,茜素红染色、VonKossa染色阳性。结论:密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化的成人骨髓间充质干细胞纯度高,表型稳定,体外加成骨诱导剂培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,具有成骨活性,可为骨组织工程和基因治疗提供比较理想的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的：观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。 方法：实验于2005—03／11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作：骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液（DMEM—LG培养基、体积分数为0．1的胎牛血清）常规培养；骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂；内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞；诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1：1的比例接种于培养板中，加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。 结果：①免疫细胞荧光染色结果：内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精一伊红染色结果：均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果：各组细胞增殖差异无显著性（P〉0．05）。④碱性磷酸酶活性：除内皮细胞诱导组外，其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高，联合培养组增长最明显，第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到（618．46&;#177;28．34）nkat／L，高于其他各组（P〈0．05）。⑤骨钙素检测结果：在培养的第7天、第14天，联合培养组的骨钙素分泌量分别为2．03，3．17μg／L，明显高于其他各组（P〈0．01）。 结论：由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性，提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的：观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法：实验于2004-10／2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只，经兔髂嵴无菌抽取骨髓，采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化，将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞，分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组（向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养，对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察），对照组（采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基），两组进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定，并进行细胞成脂和成骨率比较。结果：从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞，其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染，8只获得成功进入结果分析。①在经过2ld成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴，苏丹脂肪染色呈橘红色，同时Kossa法也检测出少许成骨分化，其比例为70％（28／40）干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞；10％（4／40）干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积，Von Kossa法测定形成的钙结节，同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化，其比例为40％（16／40）干细胞可转化为成骨细胞，20％（8／40）骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5％（2／40）骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞，用Von Kossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10％（4／40）。结论：在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞，另一部分转化为成骨细胞，两者分化存在一定关系：分化的脂肪细胞多，则成骨细胞少；分化的成骨细胞多，则脂肪细胞少。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景:目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少.目的:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点.方法:全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化.结果与结论:培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性.扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃.     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

低渗结合自然沉降法分离兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

背景：骨髓间充质干细胞数量极少,10万个骨髓有核细胞中才有1个骨髓间充质干细胞,如何成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞是研究中的关键工作。目的：建立完善的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,从细胞的形态、表型和功能方面鉴定骨髓间充质干细胞。方法：低渗原理去除杂细胞,结合自然沉降分离骨髓间充质细胞,并对其形态学特征进行光镜观察。对骨髓间充质细胞的表型进行流式细胞仪检测。并将骨髓间充质细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化,行形态学观察和碱性磷酸酶、Vonkossa、Ⅰ型胶原、油红O染色检测。结果与结论：实验分离获取的骨髓间充质细胞经表型鉴定为：CD29（＋）,CD45（-）;向成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶、矿化结节染色及Ⅰ型胶原检测均为阳性;向脂肪细胞诱导后,油红O染色阳性。结果表明实验分离的骨髓间充质细胞为类成纤维细胞样非造血类干细胞,此类细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的功能。     

组织块法培养SD大鼠的成骨细胞及鉴定

背景：获得足够量高纯度的成骨细胞比较困难,因此掌握简单而快速提取成骨细胞并进行培养鉴定势在必行。目的：应用组织块法对SD大鼠成骨细胞的体外培养与鉴定。方法：取新生（〈24h）SD大鼠颅骨,去除周围多余的组织,将剔净颅骨剪成1mm3大小的碎块,分别用常规方法和组织块法（改良）方法进行成骨细胞培养,从形态学、碱性磷酸酶和茜苏红染色等方法鉴定。结果与结论：利用改良方法培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性染色,茜素红染色后有矿化结节的形成。组织块法培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞成分单一、细胞培养时间短、数量、纯度、密度均一致,从而的得到稳定的成骨细胞系,为进行体外实验建立了良好的平台。     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,VonKossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14～21天,两组的VoKossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。     

MC3T3-E1Subclone14体外诱导成骨细胞模型的建立

目的 建立MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨细胞模型,为进一步了解成骨细胞形成机制打下实验基础.方法 MC3T3-E1 Subclone 14细胞培养至贴壁,加入条件培养基:L-抗坏血酸(50μg/mL)、β-甘油磷酸钠(10mmol/mL)、地塞米松(10-8mol/mL),培养至21d.倒置显微镜观察细胞形态;碱性磷酸酶(ALP)、Von Kossa染色鉴定成骨细胞和骨细胞;RT-PCR、Western-blot检测成骨细胞相关基因骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白等相关生物学指标mRNA和蛋白表达水平,以鉴定成骨细胞体外形成.结果 1.体外诱导MC3T3-E1 Subclone 14至7d,倒置显微镜观察细胞成梭形;2.10d ALP染色结果显示:成骨细胞呈红色;3.14d Von Kossa染色结果显示:细胞表面有矿化结节形成;4.相关基因骨钙素,骨桥蛋白,骨唾液酸蛋白的mRNA和蛋白水平在14d均发生变化.结论 成功建立了MC3T3-E1 Subclone 14体外诱导成骨细胞形成模型.     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈＂S＂型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

兔骨髓基质细胞的体外分离培养及诱导成骨的实验研究

目的 探讨兔骨髓基质细胞（BMSCs）的体外分离培养及定向诱导成骨的方法。方法 选择10周龄新西兰兔，抽取其股骨大转子部骨髓，体外分离纯化得到BMSCs，再利用条件培养液将其向成骨方向定向诱导培养。采用碱性磷酸酶（ALP）和冯库萨（Von Kossa）染色方法，鉴定其成骨性能。结果 BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖，经ALP和Yon Kossa染色证实其有成骨潜能。结论 兔BMSCs的体外培养增殖能力强，能诱导分化为成骨细胞，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。