Gro许旺细胞在不同孔径丝素蛋白支架上的生长(英文)

背景:细胞在生物支架上的生长行为受到支架表面形貌、润湿性、孔径及孔隙率等多种因素影响。目的:观察许旺细胞在不同孔径丝素蛋白支架上的生长情况。方法:制备大孔径50～60μm、小孔径10～20μm两种多孔丝素材料。选用许旺细胞永生化细胞R3[33-10ras3]为种子细胞,当细胞在培养瓶底形成致密单层时即可消化细胞并进行接种实验,将许旺细胞悬液种于不同形貌的多孔丝素材料表面。复合培养1周后,扫描电镜观察许旺细胞的生长形态及增殖等情况。结果与结论:不同孔径丝素材料的表面可见许旺细胞生长情况不一。在10～20μm孔径材料支架上,细胞浓度较低,细胞表现为特异的双极性形态,细胞与细胞之间或平行排列,或首尾相连成细胞链;细胞与细胞之间或平行排列,或首尾相连成细胞链;在50～60μm孔径丝素材料支架上,细胞浓度较高,细胞多为球形,单个分散在多孔支架表面,或呈现成团成串葡萄样聚集在孔的底部,未延展成双极性形态,只有极少量生长在孔与孔之间嵴上的细胞呈双极样。说明多孔丝素蛋白支架的孔径对许旺细胞的黏附、生长有一定的影响,许旺细胞更适合生长在孔径略大于胞体直径的支架材料上。     

肝细胞特异性大孔微载体的制备与表征

背景：在肝细胞移植及生物人工肝的研究中,肝细胞培养是关键环节,肝细胞表面存在着去唾液酸糖蛋白受体和半乳糖基之间的分子识别功能,如何方便地获取足够数量、活性较好、功能良好的肝细胞已经成为其首要问题. 目的：制备一种新的体外三维环境下具有肝细胞特异性的高性能的大孔微载体. 方法：以丝素蛋白、壳聚糖及乳糖酸为基本材料,通过乳化-化学交联、冷冻干燥、极性溶液处理制备一种新型丝素蛋白/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体.采用光学显微镜、扫描电子显微镜和通过超导核磁共振波谱、傅里叶变换红外光谱及细胞相容性等对其形态结构及理化性质进行表征. 结果与结论：实验所制备的丝素蛋白/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体,内外多孔且相互连通,具有肝细胞特异性.扫描电子显微镜下观察显示,该大孔微载体表面呈多孔结构,孔径为40-80μm,开口向外,呈喇叭状,孔的分布均匀,内部亦为多孔结构,适合于肝细胞高密度培养.超导核磁共振波谱、傅里叶变换红外光谱检测结果显示,半乳糖基已经成功复合到支架材料之中.细胞相容性实验结果显示,肝细胞能与材料特异性黏附、细胞围绕微载体聚集生长,并表现出很好的活力.结果证实,应用乳化-化学交联、极性溶液处理、冷冻干燥等方法可制备出具有肝细胞特异性亲和力的丝素蛋白/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体.     

人牙髓细胞复合不同孔径羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料的生物学行为

背景:有文献表明,通过组织工程的方法将人牙髓细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙多孔支架材料修复牙缺损具有可行性.然而究竟多大孔径的支架材料最有利于人牙髓细胞的生长及分化,至今尚无定论.目的:观察人牙髓细胞复合不同孔径羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料后黏附、增殖和分化等生物学行为.方法:人牙髓细胞接种至3种不同孔径的羟基磷灰石/磷酸三钙材料上,采用荧光显微镜以及扫描电镜检测细胞在材料表面的黏附生长情况,然后通过细胞的黏附率实验与MTT比色法观察人牙髓细胞在材料表面的黏附与增殖特性.不同孔径的羟基磷灰石/磷酸三钙支架复合人牙髓细胞后分别用生长培养基和矿化诱导液培养,于接种后第4,7,10天检测碱性磷酸酶活性.结果与结论:人牙髓细胞在3种不同孔径支架材料表面和孔隙内均能顺利黏附并增殖.其中100～300 μm组支架材料黏附率最高,MTT结果显示接种3 d后300～500 μm组能较好地促进细胞增殖.培养10 d后,复合在100～300 μm和300～500μm材料上的人牙髓细胞,其碱性磷酸酶活性显著高于500-700 μm组.提示与500～700 μm孔径相比,孔径为100～300μm和300～500 μm的羟基磷灰石/磷酸三钙材料能更好地促进人牙髓细胞黏附、增殖和分化.     

多孔丝素材料组织相容性的初步研究

背景：丝素蛋白支架材料被植入生物体内后会发生降解且无法完全与宿主组织分离,这类材料生物相容性的研究大多为体外实验,其体内的组织相容性和降解过程的研究结果仍不充分。目的：初步观察多孔丝素材料的体内组织相容性。方法：将多孔丝素支架埋藏于SD大鼠背部皮下,术后2,4,6,8周分别取材,对伤口局部及材料情况大体观察,然后材料切片苏木精-伊红染色行组织学观察。结果与结论：动物伤口愈合良好,多孔丝素表面形成极薄的纤维包裹,周围组织反应轻微。组织切片见炎细胞浸润,以巨噬细胞为主,支架材料边缘孔隙内有成纤维细胞和毛细血管长入。8周时材料边缘部分可见支架结构崩解现象,而材料内部变化不大。结果显示组织细胞可以沿多孔丝素支架表面贴附生长,提示支架材料具有较好的组织相容性。     

新型三维编织型生物支架的研制及体外生物相容性

背景:脊髓损伤后,由于有胶质瘢痕的阻隔,使再生的轴突难以穿越损伤区域,从而影响脊髓功能的恢复.随着组织工程技术的发展,研究人员尝试利用在三维支架的空间诱导作用下,让再生的轴突和支架内部携带的细胞能够三维有序的生长,穿越瘢痕屏障,连接脊髓损伤断端.目的:采用编织工艺研制新型以聚乙交酯-丙交酯为原料的三维支架,检测新型支架与许旺细胞的生物相容性.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成.材料:选择聚乳酸:聚羟基乙酸为9:1的聚合材料聚乙交酯-丙交酯,通过熔融纺丝、拉伸、编织等步骤制作聚乙交酯-丙交酯三维支架.取新生3 d SD乳鼠的坐骨神经,分离、纯化许旺细胞.方法:实验分3组:三维支架组将许旺细胞接种在新型三维支架内培养;明胶海绵组将许旺细胞接种在胶原海绵上培养;细胞培养皿组直接接种在预涂左旋多聚赖氨酸的24孔培养板上培养.主要观察指标:扫描电镜观察内部微管道的排列规律,测量其孔径大小、孔隙率等指标.通过倒置相差显微镜和扫描电镜观察许旺细胞在支架上生长情况,包括许旺细胞在支架上的黏附、增殖和凋亡情况等.结果:支架外径为3 mm,微管道内径为100 μm,呈均匀平行排列,支架的孔隙率为68%.三维支架组与细胞培养皿组中的许旺细胞黏附、增殖差异无显著性意义,与明胶海绵组差异有显著性意义.三维支架组与明胶海绵组中细胞凋亡差异无显著性意义,它们均低于细胞培养皿组,差异有显著性意义.结论:新型三维编织型支架具有良好的生物相容性.     

兔许旺细胞与猪小肠黏膜下层的体外复合培养

背景：国内外研究以大鼠许旺细胞与小肠黏膜下层复合修复神经缺损,取得了较好结果。目的：观察兔许旺细胞与猪小肠黏膜下层体外共培养的生物相容性。方法：采用分步酶消化法分离培养新西兰大白兔许旺细胞,取第3代许旺细胞接种在猪小肠黏膜下层上。结果与结论：①苏木精-伊红染色：复合培养24h后细胞在材料上良好黏附。1周时部分细胞在猪小肠黏膜下层基质层表面呈单层生长,细胞扁平,细胞核呈长梭形,细胞间连接紧密。2周后,细胞呈多层生长。②扫描电镜：复合培养2d,细胞黏附于材料表面并伸展,细胞体呈纺锤形,从胞体伸出两根细长突起,相邻细胞的突起首尾相接连成细胞链或融合或交联或在纤维的侧方平行生长;1周后细胞在材料上大量增殖,呈串珠链黏附于支架上,类似于神经中的Bunger带。表明小肠黏膜下层与许旺细胞有良好的相容性。     

丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料的制备方法

背景：很多研究表明丝素蛋白、壳聚糖为天然高分子材料,无毒无味,有良好的生物特性和理化性质。目的：探讨符合软骨组织工程支架材料要求的丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料制备方法。方法：将丝素蛋白与壳聚糖按质量比分别为3∶1,1∶1,1∶3,0∶1的比例混合制备丝素蛋白-壳聚糖复合材料,通过孔径大小、孔隙率、吸水膨胀率及热水溶失率的测定,寻找丝素蛋白/壳聚糖最佳混合比例。结果与结论：丝素蛋白/壳聚糖按质量1∶1的比例混合更符合要求：孔径90～280μm,平均孔径为151.72μm;孔隙率为（92.72±4.78）%;吸水膨胀率为（141.10±6.87）%;热水溶失率交联后较交联前降低,交联前后比较差异有显著性意义（P〈0.05）。说明丝素蛋白/壳聚糖按1∶1复合支架材料符合软骨组织工程支架材料理化性质的要求,该材料有望作为软骨组织工程研究较理想的支架材料。     

多孔丝素材料组织相容性的初步研究

背景:丝素蛋白支架材料被植入生物体内后会发生降解且无法完全与宿主组织分离,这类材料生物相容性的研究大多为体外实验,其体内的组织相容性和降解过程的研究结果仍不充分。目的:初步观察多孔丝素材料的体内组织相容性。方法:将多孔丝素支架埋藏于SD大鼠背部皮下,术后2,4,6,8周分别取材,对伤口局部及材料情况大体观察,然后材料切片苏木精-伊红染色行组织学观察。结果与结论:动物伤口愈合良好,多孔丝素表面形成极薄的纤维包裹,周围组织反应轻微。组织切片见炎细胞浸润,以巨噬细胞为主,支架材料边缘孔隙内有成纤维细胞和毛细血管长入。8周时材料边缘部分可见支架结构崩解现象,而材料内部变化不大。结果显示组织细胞可以沿多孔丝素支架表面贴附生长,提示支架材料具有较好的组织相容性。     

壳聚糖修饰丝素蛋白与人脂肪间充质干细胞体外构建组织工程脂肪

背景：在保留丝素蛋白原有优点的基础上,采用带正电荷的水溶性壳聚糖对其表面进行修饰,可改善细胞在支架材料上的黏附性。目的：验证壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料与人脂肪间充质干细胞的生物相容性及两者体外构建组织工程脂肪的可行性。方法：将第3代人脂肪间充质干细胞悬液以1×107 L-1浓度接种于壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料上作为实验组,以单纯的细胞悬液为对照组,MTT法检测细胞在支架材料上的黏附和增殖能力。将第3代人脂肪间充质干细胞悬液以1×109 L-1浓度接种于壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料上,分别进行成脂诱导培养与高糖培养基常规培养,14 d后行细胞-支架复合物油红O染色与RT-PCR检测。结果与结论：人脂肪间充质干细胞在壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料上黏附、增殖良好。成脂诱导14 d后,油红 O 染色显示壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上有大量脂肪细胞生成,且过氧化物酶增殖物活化受体γ2基因表达阳性。结果表明壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料具有良好的体外生物相容性,与人脂肪间充质干细胞共培养可被成功诱导为成熟脂肪细胞。     

壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞的体外复合培养

背景:壳聚糖与丝素有各自的优点和不足,将两者共混,可取长补短,改善性能.进行壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞体外复合培养的研究,可进一步为工程化组织构建打下基础.目的:将壳聚糖-丝素支架与大鼠真皮间充质干细胞体外复合培养,探讨壳聚糖-丝素支架对真皮间充质干细胞吸附、生长及增殖的影响.方法:①壳聚糖和丝素以质量比为3:7充分搅拌混匀,冻干制作壳聚糖-丝素海绵状支架,并测其孔径、孔隙率等指标.②将该支架与大鼠真皮间充质干细胞复合进行体外培养,倒置相差显微镜观察细胞与支架复合生长、基质形成以及细胞与支架结合的情况.分别于培养6,12,24 h消化支架上的细胞,计算细胞吸附率.于培养2,4,6,8,10 d后,用MTT法检测细胞增殖率情况.以无支架的细胞培养作为对照组.结果与结论:①倒置相差显微镜及扫描电镜下观察发现该支架有分布较均匀且细密的小孔,孔与孔之间相互连通,孔径大小较均匀,孔径在100～150 μm之间,孔隙率为90.3%.②24 h内,真皮间充质干细胞对支架的黏附率随着时间的增加而逐渐增高,24 h时的黏附率为93%,表明真皮间充质干细胞可良好地黏附于壳聚糖-丝素支架上.③MTT法检测细胞增殖结果显示,于培养各检测时间点,实验组与对照组比较差异均无显著性意义.于培养早期(第2,4天),对照组增殖细胞数略高于实验组;于培养第10天,实验组的增殖细胞数略高于对照组.倒置相差显微镜观察细胞于支架上的形态和附着良好,并有较旺盛的细胞基质分泌.表明真皮间充质干细胞在该支架上能良好地生长、增殖.提示壳聚糖-丝素支架是真皮间充质干细胞体外培养的良好支架材料.     

丝蛋白应用于牙周组织工程的可行性

背景：丝蛋白是有利于表皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、胶质细胞黏附和生长的一种新型生物材料。目的：评估丝蛋白作为支架材料应用于牙周组织工程的可行性。方法：采用组织块法培养人牙周膜细胞,将第5代细胞悬液以2×107L-1的浓度接种到丝蛋白支架材料上复合培养,并以1%,10%,50%,100%的丝蛋白支架浸提液培养,观察人牙周膜细胞在丝蛋白上及在丝蛋白浸提液中生长状况,用MTT法测定浸提液培养人牙周膜细胞的活力。结果与结论：扫描电镜可见人牙周膜细胞在丝蛋白支架上伸展充分,生长旺盛,不同浓度丝蛋白支架浸提液培养对人牙周膜细胞的增殖与碱性磷酸酶活性均无影响。说明丝蛋白材料具有良好的生物相容性、独特的力学性能,可作为人牙周膜细胞黏附生长的理想支架材料较好地应用于牙周组织工程中。     

适宜于构建组织工程化脂肪的蚕丝蛋白支架:最佳孔径筛选

背景:既往组织工程脂肪的研究中,支架材料的孔径往往被忽略.如孔径过大,细胞会顺着过大的孔隙流走,难以保留在支架中;孔径过小,细胞则主要分布于支架材料的表面,不易进入支架中,同时也不利于新生血管生长.目的:筛选用于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架的适宜孔径.方法:在保持蚕丝蛋白浓度不变条件下,通过改变冷冻干燥温度与时间,制备出6批次不同孔径的蚕丝蛋白支架;贴壁法分离脐带间充质干细胞,化学染色检测其体外诱导成骨和成脂的能力;电镜下测定6批次蚕丝蛋白支架的孔径;观察脐带间充质干细胞在不同孔径蚕丝蛋白支架上黏附、增殖的能力.结果与结论:6批次蚕丝蛋白支架的孔径分别为:(39.94±17.27),(53.51±16.18),(63.97±19.76),(71.08±18.07),(87.33+21.78),(121.97+44.10)μm.脐带间充质干细胞在2号支架材料上黏附良好,并充分伸展,而第1,3,4,5,6号支架材料,除第1,3号支架上偶见细胞外,其余支架材料上均未见细胞生长.由此说明人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪时,支架材料的最佳孔径为50 μm.     

天然及合成尿道重建支架材料的生物相容性及力学性能

背景：目前应用何种尿道组织工程修复重建支架材料更为合适的争论仍不断出现,其生物相容性及力学特性的评估也鲜见报道。目的：评估应用于尿道修复重建多种生物材料的力学特性及生物相容性。方法：脱细胞法制备小肠黏膜下层组织、膀胱脱细胞基质以及脱细胞尿道海绵体基质,同时编织法制备聚乙醇酸支架。单轴拉伸测试测定各类支架生物力学特性,光镜及扫描电镜测定支架表面孔径大小。线粒体代谢活性MTT法检测各种生物材料的细胞毒性。所有支架表面接种海绵体平滑肌细胞,体外培养14d后进一步评估细胞渗透情况。结果与结论：生物力学评估显示脱细胞尿道海绵体基质在弹性模量以及断裂强度方面的检测结果明显优于其余材料（P〈0.05）。MTT结果显示所有支架材料均支持正常的细胞生长代谢,并未发现存在明显的细胞毒性。聚乙醇酸在扫描电镜中显示出最大的孔径（〉200μm）,同时脱细胞尿道海绵体基质的尿道面（〈5μm）和海绵体面（〉10μm）观察到明显不同的孔径大小。细胞接种14d后聚乙醇酸材料的内部可见种子细胞的广泛分布,在膀胱脱细胞基质以及脱细胞尿道海绵体基质的尿道面未发现有明显的细胞渗透迹象,而小肠黏膜下层组织和脱细胞尿道海绵体基质的海绵体面观察到明显的细胞渗透生长表现。提示所有支架材料显示出良好的生物相容性,同时在力学特性方面也与正常尿道组织相仿,但脱细胞尿道海绵体基质在力学和组织学的诸多参数上具有一定的优越性。     

Annulus fibrosus tissue engineering using lamellar silk scaffolds

Degeneration of the intervertebral disc (IVD) represents a significant muscular skeletal disease. Recently, scaffolds composed of synthetic, natural and hybrid biomaterials have been investigated as options to restore the IVD; however, they lack the hallmark lamellar morphological features of annulus fibrosus (AF) tissue. The goal of regenerating the disc is to achieve anatomical morphology as well as restoration of mechanical and biological function. In this study, two types of scaffold morphology formed from silk fibroin were investigated towards the goal of AF tissue restoration. The first design mimics the lamellar features of the IVD that are associated with the AF region. The second is a porous spongy scaffold that serves as a control. Toroidal scaffolds were formed from the lamellar and porous silk material systems to generate structures with an outer diameter of 8 mm, inner diameter of 3.5 mm and a height of 3 mm. The inter‐lamellar spacing in the lamellar scaffold was 150–250 µm and the average pore sizes in the porous scaffolds were 100–250 µm. The scaffolds were seeded with porcine AF cells and, after growth over defined time frames in vitro, histology, biochemical assays, mechanical testing and gene expression indicated that the lamellar scaffold generated results that were more favourable in terms of ECM expression and tissue function than the porous scaffold for AF tissue. Further, the seeded porcine AF cells supported the native shape of AF tissue in the lamellar silk scaffolds. The lamellar silk scaffolds were effective in the formation of AF‐like tissue in vitro. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

羟基丁酸-羟基辛酸聚合物-胶原骨软骨支架的制备及应用

背景：关节软骨修复的关键是软骨和软骨下骨的整体修复,然而目前尚缺乏理想的一体化支架。目的：制备聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架,并分析其基本生物学特性。方法：以聚羟基丁酸-羟基辛酸、Ⅰ型胶原为材料,通过溶剂浇铸-颗粒沥滤法制备聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架,观察支架超微结构,支架孔径及孔与孔的连通情况;液体置换法测定支架孔隙率。将乳兔骨髓间充质干细胞接种于聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架上,扫描电镜观察细胞在支架上的黏附状态,MTT法测定细胞在支架上的生长曲线。结果与结论：一体化支架呈疏松多孔结构,软骨层孔径80-100μm,骨层孔径200-220μm,孔隙率（80.0±2.3）%。骨髓间充质干细胞在支架上黏附状态良好,增殖迅速。说明聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原骨软骨一体化支架具备适宜的孔隙结构和良好的生物亲和性。     

丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架材料的表征及细胞相容性

背景:丝素蛋白和透明质酸具备细胞外基质两种主要成分特征,并且有良好的生物相容性。目的:采用冷冻干燥法制备丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架,并观察其表征与细胞生物相容性。方法:将丝素蛋白与透明质酸按10:1混合通过冷冻干燥法构建丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架并观察其表征。将1×108L-1的第3~5代大鼠骨髓间充质干细胞接种在丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架上观察其细胞生物相容性。结果与结论:采用冷冻干燥法可以成功制备丝素蛋白/透明质酸复合多孔支架,与纯丝素蛋白支架相比,复合支架具有更好的多孔三维结构。此外,支架制备过程中不含有毒溶剂,支持骨髓间充质干细胞的黏附铺展与增殖。说明实验制备的丝素蛋白/透明质酸复合支架的成孔性好,具有良好的细胞生物相容性。     

丝素-壳聚糖复合制作的三维可降解多孔支架

背景:单独使用天然材料如胶原、明胶及纤维蛋白制备的支架虽然解决了生物相容性等问题,但由于其降解太快,在作为细胞支架时往往提前塌陷而达不到诱生新组织的目的.目的:探讨应用丝素与壳聚糖复合制作生物可降解三维多孔的支架,并对其特性进行检测.设计、时间及地点:材料学观察实验,于2008-06/2009-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成.材料:春蚕茧由浙江省海宁市马桥镇黄墩庙村蚕农赠送,壳聚糖为上海伯奧生物科技有限公司产品.方法:通过脱胶、溶解、透析这3个主要步骤制成质量浓度为15 g/L的丝素溶液,将壳聚糖溶解在2%的醋酸溶液中制成25g/L.的壳聚糖-乙酸溶液,然后将两者混合,配制成丝素/壳聚糖质量比分别为10:0,5:5,4:6,3:7,2:8,0:10的6种溶液,分别吸入24孔板中,4℃排出气泡后,-20℃预冷冻12 h,再冷冻干燥30 h.取出后梯度乙醇水化,再用NaOH-乙醇溶液中和稳定1h,漂洗后再次冻干.主要观察指标:光镜和扫描电镜观察各种质量比配制的支架孔径、结构;采用改良的液体替代法测定各种支架的孔隙率;测定各种支架在体外4周的降解率.结果:丝素/壳聚糖质量比为10:0制成的支架孔隙粗大,非常蓬松,易碎,溶失率太高;相反仅以壳聚糖制成的支架冻干后较硬,缺乏足够的弹性;以5:5,4:6,3:7,2:8制成的复合支架冻干后,支架较松软,类似海绵,随着壳聚糖浓度增加,支架硬度增加,支架上有分布均匀且细密的小孔.光镜下各个孔形态不规则,每个孔紧密相连并联通,孔径大小均匀,孔径20~100 μm,随着壳聚糖浓度增加,孔径逐渐减小.支架孔隙率测定结果显示,丝素/壳聚糖质量比为4:6组>5:5组>3:7组>2:8组,与丝素/壳聚糖质量比为2:8组比较,5:5组和4:6组的支架孔隙率均明显增大(P<0.05).各种质量配比制成的丝素-壳聚糖复合支架吸水膨胀率无明显差异(P>0.05).第4周时丝素/壳聚糖质量比为2:8组降解最慢,5:5组降解最快.结论:在理化性能方面,将丝素与壳聚糖混合制作的复合支架较单纯用丝素或壳聚糖制作的支架均显示出明显优势,其中用丝素/壳聚糖质量比为5:5及4:6制成的复合支架最符合软骨组织工程的需要.