白细胞介素6体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞是肝细胞的重要肝外来源,在多种细胞因子和生长因子诱导下可分化为肝细胞,从而参与肝功能的修复和重建.目的:观察白细胞介素6是否可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化.方法:采用贴壁法分离培养昆明种雄性小鼠骨髓间充质干细胞,在无血清肝细胞培养液HEPATOZYME-SFM中分别加入2.5,5,10,20 μg/L白细胞介素6诱导其向肝样细胞分化;诱导培养0,7,14,21,28 d时取出细胞爬片,细胞免疫组织化学法检测细胞角蛋白18、甲胎蛋白表达情况,过碘酸-Schiff糖原染色检测细胞功能,ELISA和硝酸还原酶法分别检测培养液中白蛋白和一氧化氮水平.结果与结论:当白细胞介素6质量浓度在2.5~10 μg/L范围内,呈浓度依赖性和时间依赖性增加细胞角蛋白18、糖原表达率及细胞培养液中白蛋白水平;甲胎蛋白表达为先升后降直至21d停止.当白细胞介素6质量浓度增加到20 μg/L时上述诱导作用均不及质量浓度10 μg/L组.只有10 μg/L白细胞介素6组诱导到28 d时细胞培养液中测得微量一氧化氮;提示白细胞介素6可诱导骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化,且在10 μg/L作用最强,质量浓度再增高时诱导作用反而减弱.     

虫草多糖体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞☆

背景:如何促进骨髓间充质干细胞向肝细胞完全意义上的转化,以便更有效改善病变肝组织的结构和功能将成为未来相关研究的重中之重。目的:探讨虫草多糖在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞的可行性。方法:采用贴壁法培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,实验分3组对骨髓间充质干细胞进行诱导分化,虫草组培养液中加虫草多糖进行诱导,终末质量浓度为0.15g/L;阳性对照组培养液中加肝细胞生长因子和表皮生长因子联合诱导,质量浓度分别为20μg/L和10μg/L;空白对照组仅用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液。结果与结论:分离纯化的骨髓间充质干细胞经流式细胞仪检测显示CD34阴性表达,CD44阳性表达。诱导分化7d时虫草组及阳性对照组细胞出现甲胎蛋白表达,14d时表达增强,28d时表达减弱,阳性对照组甲胎蛋白阳性率高于虫草组;诱导分化7d时阳性对照组细胞角蛋白18出现表达,14d时表达增强,虫草组则在14d时出现表达,而后持续。诱导分化7d时虫草组及阳性对照组白蛋白表达阴性,14d时出现阳性。诱导分化14d时虫草组及阳性对照组细胞糖原染色阳性,28d时表达减弱。空白对照组结果皆为阴性。结果可见虫草多糖可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞。     

诱导人骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化过程中肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景:骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓内的非造血干细胞,因其具有自我更新能力及多向分化潜能,且分离培养方法成熟,在组织器官修复及再生方面显示出良好的应用前景,将为终末期肝病的治疗如生物人工肝及肝细胞移植提供新的细胞来源,但目前人骨髓间充质干细胞向肝系细胞诱导分化培养体系尚不成熟。目的:观察肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合应用诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝系细胞分化的可能性。设计:开放性实验。单位:南昌大学第一附属医院传染科与泌尿外科研究所。材料:实验于2004-07/2005-03在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。所用骨髓由成年健康志愿者提供(均对本实验知情同意)。DMEM/F12培养基(Gibco公司);表皮细胞生长因子,肝细胞生长因子,胰岛素,转铁蛋白,鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体,FITC-兔抗鼠IgG(Sig-ma公司);碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen公司);鼠抗人角蛋白18,19单克隆抗体(Chemicon公司);胎牛血清(杭州四季青)。方法:以骨髓腔穿刺方式抽取成年健康志愿者髂后上棘处骨髓10mL,采用密度梯度离心法分离和反复贴壁法纯化骨髓间充质干细胞。取培养至4～8代细胞,消化后以107L-1接种到放置20mm×20mm爬片的预先铺被有0.1%明胶的24孔板中,次日换液,改用无血清DMEM/F12培养基(含20μg/L的表皮细胞生长因子和10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子)培养2d后,换成无血清DMEM/F12培养基(含20μg/L的肝细胞生长因子,10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子,5mg/L的胰岛素,5mg/L的转铁蛋白)进行诱导分化,每3d换液1次,以未加入肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞作为对照组。骨髓间充质干细胞诱导培养过程中,放射免疫荧光法测甲胎蛋白浓度。诱导当天及第7,14,21,28天,取诱导细胞爬片,细胞免疫荧光法检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、角蛋白18和角蛋白19的表达,并进行糖原染色检测诱导细胞的糖原合成情况。主要观察指标:①细胞形态学观察。②培养上清液中甲胎蛋白表达量的测定。③肝细胞表面标志检测结果。④诱导细胞的糖原合成情况。结果:①诱导第14天可观察到细胞变成短梭形和多角形,随培养时间的延长多角形细胞增多,并可形成肝细胞样的细胞集落。②诱导第14天培养上清液内可检测到甲胎蛋白的分泌,每孔浓度为0.1μg/L;第17天达高峰0.4μg/L;第21天下降至0.3μg/L。③诱导第14天甲胎蛋白、角蛋白18表达呈阳性,第28天角蛋白19表达呈阳性。④诱导第21天糖原染色呈阳性反应。结论:肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能够诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝细胞分化,表达肝细胞特异性表面标志,并具有合成糖原、分泌甲胎蛋白的功能。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的:观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法:实验于2003-12/2004-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者,来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞,分为2组,分化组于加入20μg/L肝细胞生长因子和10μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化,空白对照组则不加任何细胞因子。2周后,行细胞形态学观察,并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18,19表达,反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平,高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果:①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29,不表达白细胞分化抗原34,11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天,部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18,19,反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒,呈阳性反应,培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论:在低血清培养体系中,采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导,证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞,诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能,表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的：观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法：实验于2003—12／2004—05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者，来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞，分为2组，分化组于加入20μg／L肝细胞生长因子和10μg／L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化，空白对照组则不加任何细胞因子。2周后，行细胞形态学观察，并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19表达，反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平，高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果：①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29，不表达白细胞分化抗原34，11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天，部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19，反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒，呈阳性反应，培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论：在低血清培养体系中，采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导，证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞，诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能，表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:多项研究表明间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能,这将为肝细胞移植、生物人工肝、肝组织工程提供大量种子细胞,也有望在急性肝衰竭、终末期肝病和遗传代谢性肝脏疾病治疗方面带来较大突破.目的:拟在体外诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化,观察其形态及功能变化.方法:取体外培养第 3 代处于对数生长期的人脐带间充质干细胞,以 1×109 L-1 的细胞浓度种植在培养瓶中,加入含体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基,设立 3 组:实验 1 组加入 20 μg/L 肝细胞生长因子+10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子,实验 2 组在其基础上另加入 20 μg/L制瘤素,空白对照组不加入任何生长因子.根据细胞生长情况,每周换液两三次.分别于培养 7,14,18 d 在倒置显微镜下观察细胞形态,采用免疫细胞化学检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白 18的表达,运用 PAS 法检测糖原的表达.结果与结论:人脐带间充质干细胞可在含 20 μg/L 肝细胞生长因子、10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 制瘤素、体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养体系中诱导分化为具有肝细胞表型和功能的细胞,且肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、制瘤素联合应用的诱导效果优于单纯应用前两者.     

大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:提供肝细胞生长因子的微环境可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。目的:实验拟验证并简化成年大鼠骨髓间充质干细胞体外向肝细胞的诱导分化。设计、时间及地点:观察实验,于2006-10/2008-05在北华大学完成。材料:实验动物为成年SD大鼠,雌雄不限,体质量180~230g。方法:采用Percoll梯度离心方法获取骨髓间充质干细胞,调整细胞密度为1×108L-1,加入含有20μg/L肝细胞生长因子培养液培养,定期更换培养液。主要观察指标:流式细胞仪检测细胞表面标志和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。培养的1,3,7,14,21,28d以细胞免疫组织化学检测细胞甲胎蛋白、细胞角蛋白18和清蛋白的表达。结果:接种后,细胞体积增大,形态多样贴壁细胞分化为体积较大的多角形和部分梭形,胞浆丰富,可见多核,接种早期细胞生长比接种晚期生长较快。分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞的表面标志为CD29 ,CD44 ,CD34-,CD45-和CD90 ,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98%以上。骨髓间充质干细胞的甲胎蛋白细胞免疫组织化学染色培养第7天即出现阳性,第14天清蛋白和细胞角蛋白18免疫组织化学染色阳性。结论:成年大鼠骨髓间充质干细胞在20μg/L肝细胞生长因子的诱导下,可分化为肝细胞。     

生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命,且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。目的:探讨肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性。方法:取大鼠股骨骨髓,用直接贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并体外传代,流式细胞仪及成骨诱导对骨髓间充质干细胞进行鉴定。将细胞按以下分组进行成肝诱导:①M0组:不添加任何因子。②M1组:20μg/L肝细胞生长因子。③M2组:20μg/L肝细胞生长因子+5μg/L碱性成纤维细胞生长因子。④M3组:20μg/L肝细胞生长因子+10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。⑤M4组:20μg/L肝细胞生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测不成熟肝细胞表型标志甲胎蛋白和成熟肝细胞表型标志细胞白蛋白的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞诱导后呈肝样细胞形态改变。甲胎蛋白在诱导第7天细胞基本为阳性着色,在诱导第14天时表达降低,21d表达为阴性。细胞白蛋白在诱导第14天细胞开始表达,而后持续。M0对照组未见阳性染色,同一时间点,M3、M4组细胞阳性染色率高于M2组(P<0.05)。提示肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用,二者有协同作用。     

肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导入脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:成纤维生长因子可促进间充质干细胞增殖、贴壁生长,但对其诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验报道为数不多.当肝细胞生长因子质量浓度达1 μg/L时,可促进肝细胞有丝分裂,它是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂.目的:体外分离培养人脐带间充质干细胞,拟揭示其生物学特性及在细胞因子联合诱导下向肝样细胞分化的能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/2009-04在暨南大学血研所完成.材料:脐带取自健康足月胎儿,产妇对实验知情同意,由广州华侨医院提供.肝细胞生长因子、成纤维生长因子为美国Peprotech产品.方法:Ⅳ型胶原酶消化+差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,取传至第3代细胞,进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定,检测其成脂、成骨能力.取第5代细胞.调整细胞密度为5×10~9 L~(-1),分为2组:对照组用含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养;诱导组在其基础上,添加20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维生长因子联合诱导其向肝样细胞分化.主要观察指标:人脐带间充质干细胞的生物学特性,人脐带间充质干细胞体外向肝样细胞的分化情况.结果:成功从人脐带中分离并纯化得到间充质干细胞,第3代细胞92.2%处在G_0/G_1期;表达CD29,CD44,CD105,不表达造血细胞标志CD34,CD45;油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,碱性磷酸酶染色后细胞质呈黑色,具有成脂、成骨能力.经肝细胞生长因子、成纤维生长因子联合诱导10 d后,RT-PCR及Western blot检测结果显示细胞表达肝细胞特异性抗原甲胎蛋白、白蛋白,对照组均呈阴性表达.结论:人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化.     

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景:对于诱导骨髓间充质干细胞成肝细胞样细胞的研究,在大鼠及小鼠及人类中已有相关报道.甲胎蛋白和白蛋白均为肝细胞系较为特异的标志.目的:进一步验证肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用.方法:采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养人骨髓间充质干细胞,以含20 μg/L肝细胞生长因子和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的低糖DMEM培养基诱导培养,对照组取同代细胞,常规培养液培养.诱导培养7,14,21和28d采用免疫组织化学方法检测甲胎蛋白和白蛋白的表达及RT-PCR技术检测白蛋白mRNA表达.结果与结论:诱导组骨髓间充质干细胞呈类上皮样细胞.诱导组在培养7d时,甲胎蛋白表达阳性率为81.5%,随着培养时间延长,甲胎蛋白阳性表达率逐渐减弱,而白蛋白阳性表达率及白蛋白mRNA表达逐渐增强,至培养28d,白蛋白阳性表达率达91.2%,对照组细胞均无白蛋白、白蛋白mRNA及甲胎蛋白表达.结果证实,肝细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为肝细胞样细胞

背景：目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的研究主要集中在不同诱导因子的诱导作用,而微环境的诱导作用研究较少。目的：观察肝细胞生长因子、胎肝细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的影响。方法：采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,反复贴壁法纯化扩增骨髓间充质干细胞;采用Ⅰ型胶原酶消化法分离孕3周大鼠胚胎肝脏细胞,差速贴壁法纯化肝脏细胞;阴性对照组骨髓间充质干细胞只加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基。诱导组在阴性对照组基础上加入一定浓度肝细胞生长因子或者与胎肝细胞共培养进行诱导分化。结果与结论：诱导组白蛋白、甲胎蛋白水平均高于非诱导组（P〈0.01）,诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18阳性,而非诱导组糖原染色、CK-18均阴性。结果显示肝细胞生长因子和胎肝细胞均可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞。     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景：近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟。目的：探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法：构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基：DMEM＋体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基（HGM）＋体积分数5%胎牛血清;HGM＋5%正常大鼠血清;HGM＋5%肝纤维化大鼠血清;HGM＋5%肝纤维化大鼠血清＋25μg肝细胞生长因子。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA法检测培养上清液中转化生长因子β1表达。结果与结论：正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要.目的:以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成.材料:Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组:空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 μg/L成纤维生长因子、8 pg/L.肝细胞生长因子、8 μg/L表皮生长因子.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平.结果:联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形.联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞:诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降.上述各指标空白对照组细胞均呈阴性.结论:成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化及黄芪甲苷的协同作用（英文）

背景：大多学者使用5-氮胞苷作为诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化。目的：观察联合应用黄芪甲苷及5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化中心肌细胞相关受体的表达。方法：选用生长良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为4组。Ⅰ组：仅更换L-DMEM培养液;Ⅱ组：100mg/L黄芪甲苷＋5μmol/L5-氮胞苷诱导24h后,更换L-DMEM培养液。Ⅲ组：10μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,更换L-DMEM培养液;Ⅳ组：5μmol/L5-氮胞苷孵育24h后,更换L-DMEM培养液。各组均每3d换液1次,诱导30d后对分化细胞进行鉴定。结果与结论：①Ⅲ组、Ⅳ组及Ⅱ组诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白Nkx2.5、cTnT及Desmin的表达均为阳性,与Ⅰ组比较,差异有非常显著性意义（P〈0.01）。Ⅱ组及Ⅲ组诱导后2周,镜下见cTnT、Desmin表达数量高于Ⅳ组（P〈0.01）。Nkx2.5在两组表达亦高于Ⅳ组,其中Ⅱ组与Ⅳ组比较,差异有极显著性意义（P〈0.01）,Ⅲ组与Ⅳ组比较,差异有显著性意义（P〈0.05）。Ⅰ组无上述蛋白的阳性表达。②诱导后2周,镜下可见Ⅱ组、Ⅲ组细胞出现心肌细胞样的节律性跳动,证明部分细胞在诱导因素的作用下,已向心肌细胞分化。结果表明用100mg/L黄芪甲苷＋5μmol/L5-氮胞苷联合诱导可产生与10μmol/L5-氮胞苷相似的诱导效果,这可能与黄芪甲苷对细胞具有保护作用,促血管内皮细胞增殖作用,增强细胞对5-氮胞苷细胞毒性的耐受,上调心肌特异性蛋白的表达有关。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4μmol/L全反式视黄酸预诱导24h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16h可见明显的扩增条带,24h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子 4 等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第 3 代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导 7,14,21 d 后观察细胞形态变化,RT-PCR 检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的 mRNA 表达;于诱导 14,21 d 行 PAS 糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至 7 d 出现甲胎蛋白 mRNA 表达,14 d 表达增高,21 d 时表达下降;14 d 时细胞角蛋白 18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导 14 d 时,胞浆白蛋白出现表达,至 21 d 时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4 等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

转化生长因子β1对骨髓干细胞分化类髓核细胞的影响

背景：转化生长因子β1是骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的首选生长因子,适当浓度能诱导骨髓间充质干细胞的增殖和分化。目的：观察不同质量浓度转化生长因子β1对大鼠骨髓间充质干细胞体外向类髓核细胞分化的影响,优化骨髓间充质干细胞体外培养条件。方法：取成年大鼠股骨骨髓,体外培养、纯化。取第3代成年大鼠骨髓间充质干细胞,实验组用加入不同质量浓度转化生长因子β1（0,1,10,20μg/L）的HG-DMEM无血清培养液诱导3,7,14,21d;对照组普通状态下用含体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM培养液自然分化。结果与结论：10μg/L转化生长因子β1诱导液诱导的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖与Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于其他实验组和对照组（P〈0.01）。各实验组14d时蛋白聚糖的表达均较3,7,21d时高（P〈0.01）。对照组各时间点蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原表达均呈阴性。提示10μg/L的转化生长因子β1能提高大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化类髓核的数量,从而使骨髓间充质干细胞发挥更高的治疗效率。     

肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景：成纤维生长因子可促进间充质干细胞增殖、贴壁生长,但对其诱导间充质干细胞向肝细胞分化的实验报道为数不多。当肝细胞生长因子质量浓度达1μg／L时,可促进肝细胞有丝分裂,它是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂。 目的：体外分离培养人脐带间充质干细胞,拟揭示其生物学特性及在细胞因子联合诱导下向肝样细胞分化的能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008—08／2009-04在暨南大学血研所完成。 材料：脐带取自健康足月胎儿,产妇对实验知情同意,由广州华侨医院提供。肝细胞生长因子、成纤维生长因子为美国Peprotech产品。 方法：Ⅳ型胶原酶消化＋差速贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,取传至第3代细胞,进行细胞表面抗原分析、细胞周期测定,检测其成脂、成骨能力。取第5代细胞,调整细胞密度为5×10^9L^-1,分为2组：对照组用含体积分数为5％胎牛血清的DMEM／F12培养液培养：诱导组在其基础上,添加20μg／L肝细胞生长因子、10μg／L成纤维生长因子联合诱导其向肝样细胞分化。 主要观察指标：人脐带间充质干细胞的生物学特性,人脐带间充质干细胞体外向肝样细胞的分化情况。 结果：成功从人脐带中分离并纯化得到间充质干细胞,第3代细胞92．2％处在G0/G1期：表达CD29,CD44,CD105,不表达造血细胞标志CD34,CD45．油红O染色后胞浆中呈现红色颗粒,碱性磷酸酶染色后细胞质呈黑色,具有成脂、成骨能力。经肝细胞生长因子、成纤维生长因子联合诱导10d后,RT-PCR及Western blot检测结果显示细胞表达肝细胞特异性抗原甲胎蛋白、白蛋白,对照组均呈阴性表达。 结论：人脐带中含有丰富的间充质干细胞,其具有较强的多向分化潜能,经肝细胞生长因子与成纤维生长因子联合诱导后,易向肝样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

人参皂苷Rg1干预骨髓间充质干细胞转化为多潜能干细胞关键基因mRNA的表达

背景：将成体细胞重编程为诱导多潜能干细胞方案主要通过反转录病毒将Oct-4,Sox2,c-Myc,Klf4等基因转入成体细胞而实现。目的：观察人参皂苷Rg1作用于骨髓间充质干细胞后,对成体细胞向诱导多潜能干细胞转化的关键性基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、NanogmRNA表达的影响。方法：培养骨髓间充质干细胞,对照组培养基为α-MEM,体积分数5%FBS,1%双抗;用药组培养基为α-MEM,体积分数15%FBS,1000U/mLRatESGRO,1%双抗,并加入6.25μmol/L和12.5μmol/L人参皂苷Rg1。检测骨髓间充质干细胞Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4,Nanog等mRNA的表达。结果与结论：人参皂苷Rg16.25μmol/L培养30d,Nanog、c-Myc、Oct、Klf4、Sox2mRNA表达均有升高,且Nanog、c-Myc与对照组差异有显著性意义。人参皂苷Rg1能促进骨髓间充质干细胞表达c-Myc,Nanog,但Nanog阳性的诱导多潜能干细胞在基因表达谱上很难与胚胎干细胞区分出来,提示人参皂苷Rg1对骨髓间充质干细胞向诱导多潜能干细胞转化可能具有促进作用。