抗菌肽Cecropin A基因原核表达及表达产物的鉴定

背景:Cecropins是一种具有抗菌活性的小分子蛋白质.采用真核细胞表达或人工合成Cecropins,效率低、成本高.目的:克隆表达家蝇抗菌肽基因Cecropin A,并对其重组表达产物进行鉴定.方法:依据GenBank中家蝇Cecropin A基因序列设计特异性引物,用RT-PCR从家蝇幼虫组织中扩增Cecropin A成熟肽基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,与表达载体中的Thioredoxin基因构成融合基因,并转化E.coli BL21.经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导表达.采用家蝇幼虫血淋巴免疫家兔获得抗血清;Western blot和三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定诱导的重组蛋白质.结果与结论:经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,E.coli BL21可表达Cecropin A成熟肽,兔抗家蝇幼虫血清、三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot结果证实表达产物为Cecropin A成熟肽.说明使用原核表达系统可以获得天然Cecropin A成熟肽.     

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。     

人早老素15’端390碱基片段的真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建表达人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒。 方法：实验于2004-12／2005一01在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。参照人早老素1mRNA结构设计合成含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，从质粒pBS—Presenilins1扩增其5’端390bp的cDNA片段，插人质粒pGEX-4T-1，转化人大肠杆菌BL21（DE3），以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷诱导表达，使其在大肠杆菌中表达以谷胱甘肽S转移酶为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白，并应用亲和层析法纯化早老素1N130肽。 结果：聚合酶链反应扩增产物约400bp，核酸序列分析结果显示，扩增产物为393bp编码130个氨基酸。重组质粒在原核细胞中表达受异丙基-B—D-硫代半乳糖苷诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带，其表观相对分子质量为13000。每升菌液可收获目的蛋白4．5mg。 结论：构建人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒，制备了基因重组型早老素1N130肽，并确认其亲水特征。     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用

目的应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽（PS）亲和标签（PStag）和葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫球蛋白（IgG）-Fc结合区（ZZ）融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础。方法应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫转印试验（Western blot）鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验（ELISA）验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果。结果在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力。结论重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持。     

人早老素1 5''''端390碱基片段的真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒。方法:实验于2004-12/2005-01在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。参照人早老素1mRNA结构设计合成含适当酶切位点的聚合酶链反应引物,从质粒pBS-Presenilins1扩增其5’端390bp的cDNA片段,插入质粒pGEX-4T-1,转化入大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,使其在大肠杆菌中表达以谷胱甘肽S转移酶为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,并应用亲和层析法纯化早老素1N130肽。结果:聚合酶链反应扩增产物约400bp,核酸序列分析结果显示,扩增产物为393bp编码130个氨基酸。重组质粒在原核细胞中表达受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带,其表观相对分子质量为13000。每升菌液可收获目的蛋白4.5mg。结论:构建人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒,制备了基因重组型早老素1N130肽,并确认其亲水特征。     

重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究

目的研究重组人干细胞因子-血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物，利用RT—PCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段，采用基因融合新策略将其融合成SCF-TPO融合基因，克隆到pGEM—T载体中，构建pET32a／SCF-TPO融合基因原核表达载体，在宿主菌E.eoliBL21(DE3)plysS中经异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCF-TPO，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测。目的蛋白经包涵体变性，金属螯合层析纯化，透析复性，用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCF-TPO融合基因的高表达，表达量占菌体总蛋白的30％以上。Western blot法鉴定表达正确，MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性，浓度为100ng／ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCF-TPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。     

戊型肝炎病毒pb166-GST融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 利用谷胱甘肽S转移酶（GST）融合基因表达系统表达、纯化及鉴定HEVpb166-GST融合蛋白，为研制戊型肝炎诊断抗原探索新的途径。方法 由本室制备的重组大肠杆菌（E．coli）B121株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导HEVpb166-GST融合蛋白表达，用BDBiosience GST蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot对纯化的蛋白进行鉴定，并对实验条件和结果进行分析。结果 在LB培养液中的E．coliB121株能稳定、高效表达HEVpb166-GST融合蛋白；纯化后的成分单一，仅在43000处有表达，该蛋白能被GST特异性抗体识别。结论 我们的方法可获得高效的重组HEVpb166．GST融合蛋白，为进一步研制戊型肝炎诊断性抗原奠定了基础。     

细胞核抗原Sm B'的基因克隆和原核表达

目的 为建立抗Sm自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定细胞核抗原Sm B’。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从HL-60细胞株中克隆Sm B’全长基因,将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（western blot）鉴定。结果PCR产物约为700 bp,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-ST-Sm B’重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS—PAGE和western blot结果显示融合蛋白分子量为51 000,具有与抗Sm B’抗体的反应性。结论成功克隆表达核抗原Sm B’,为建立抗Sm自身抗体检测方法奠定了基础。     

艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件优化及其纯化

目的：优化艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件,在获得高表达融合蛋白后对其进行纯化,为艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3单克隆抗体的制备奠定基础。方法以诱导前菌液600 nm处的光密度值（OD600）、诱导温度、诱导剂异丙基-β-D巯基半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间为单变量,分别诱导融合蛋白的表达,在此基础上采用正交试验对融合蛋白的诱导表达条件进行优化,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳半定量分析融合蛋白的表达量及表达形式,以Western blot对融合蛋白进行鉴定,以GST 亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。结果融合蛋白诱导表达的最佳条件为诱导前菌液OD6000．8、IPTG浓度0．6 mmol/L、诱导时间12 h、诱导温度30℃,融合蛋白以可溶性蛋白表达形式为主,经纯化后,融合蛋白纯度超过90％。结论本研究成功优化了艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白的诱导表达条件,获得大量表达,并成功对其进行了纯化,为后续单克隆抗体的制备奠定了基础。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化

背景：次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21）是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性。目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白。方法：取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly（I：C）刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列。克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21。将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达。CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化。结果与结论：实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白。结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白。     

新等位基因人类白细胞抗原B＊15：133的鉴定及其原核表达

背景：国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究。目的：在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达。方法：利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选。使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析。用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达。结果与结论：发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B＊15：18：01在第419位相差一个核苷酸,C-〉T,即Codon116位TCC-〉TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。最终确定命名为人类白细胞抗原B＊15：133。血清学表达B71（70）抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。表达载体pET30a（＋）-B＊15：133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B＊15：133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a（＋）-B＊15：133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达。     

DerP2基因真核表达载体构建及其在小鼠树突状细胞中的表达

背景：树突状细胞是目前已知的最强大的抗原提呈细胞，已经被应用于免疫治疗的研究中。目的：构建DerP2真核表达载体，并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞中表达。设计、时间及地点：单～样本观察，实验于2005-05／12在解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所完成。材料：C57BL／6小鼠；plambd—DerP2购自美国HESKA公司；pCI-neo质粒为解放军第三军医大学新桥医院全军呼吸疾病研究所保存。方法：体外分离，培养小鼠骨髓来源树突状细胞。将原核表达质粒plambdDerP2携带的DerP2全长cDNA切下，重组到真核表达质粒pCl-neo中，然后在脂质体介导下，将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的树突状细胞，以未转染质粒和转染空白载体pCl—neo的树突状细胞为对照。主要观察指标：①pCl—neoDerP2重组质粒结构鉴定。②并用反转录-聚合酶链反应、Western Blot检测DerP2mRNA和蛋白表达。结果：测序证实构建的重组质粒中携带了DerP2的全长cDNA序列，且与GeneBank序列完全一致。反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测结果提示，重组质粒转染的树突状细胞能表达DerP2mRNA和DerP2蛋白。结论：成功构建重组DerP2基因真核表达载体，其转染树突状细胞后，能有效地表达于树突状细胞中。     

构建重组人pET-32a-瘦素高效的表达载体

背景：瘦素的功能是作为脂肪细胞体脂量的信号来认识的,作为体内的能量平衡信号反馈到下丘脑,与其中各部位神经元的受体结合后参与调节进食、饮水、能量代谢。目的：构建原核重组表达载体pET-32a-瘦素并检测其在大肠杆菌BL21中的高效表达。方法：取人脂肪组织,RT-PCR法制备瘦素目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pMD18T与pET-32a原核表达载体,双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌BL21株诱导其表达,SDS-PAGE电泳分离鉴定,表达产物变性复性后,间接酶联免疫吸附法检测抗原反应原性。结果与结论：实验成功扩增出520bp的瘦素目的基因并构建了原核重组表达载体pET-32a-瘦素;测序结果与GenBank收录序列相一致;目的蛋白pET-32a-瘦素呈极高效表达,占总蛋白的50%以上;变性复性后抗原反应原性较复性前明显提高（P〈0.01）。结果证实,实验成功构建原核重组高效表达的载体pET-32a-瘦素,并提高其抗原反应原性。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

MK—EGFP融合蛋白的构建和表达

目的克隆中期因子（midkine，MK）的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因，构建原核表达质粒pET—MK-EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋白大量表达，并具有完整的生物学活性。     

C57BL小鼠survivin基因miRNA表达载体的构建

背景：Survivin在多种肿瘤组织中的高表达,具有调节细胞增殖分裂和强大的抗凋亡功能。目的：利用RNA干扰技术,构建具有特异性阻断C57BL小鼠survivin基因的微小RNA（micro RNA,miRNA）表达载体。设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-06/11在重庆医科大学附属第一医院神经内科实验中心完成。材料：环形pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR和BLOCK-iTTM PolII miR RNA干扰Expression Vector Kit with EmGFP为Invitrogen公司产品;DH5a大肠杆菌为实验室保存;xhoI和BamHI酶、壮观霉素均为上海生工生物工程有限公司产品。方法：应用设计软件在C57BL小鼠survivin基因的mRNA上寻找特异性的短核苷酸序列,并设计合成4对寡核苷酸序列,经退火后形成双链DNA片段,采用基因克隆技术,将其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR的载体中,转化DH5a大肠杆菌,挑单菌落种于含有壮观霉素LB液体培养基中,提取质粒。主要观察指标：应用测序法和琼脂糖电泳检测对重组体进行鉴定。结果：测序结果显示插入片段与线性载体连接正确,无碱基突变、缺失、插入等异常。双酶切处理pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR重组质粒结果显示片段大小与预期相符。结论：实验结果表明成功构建了C57BL小鼠survivin基因的微小RNA表达载体。     

mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达

背景：干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低。目的：通过比较mdx小鼠和C57小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx小鼠骨骼肌病理改变的可能机制。方法：取mdx小鼠与C57小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx小鼠和C57小鼠骨骼肌组织总RNA,real-timePCR检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达。结果与结论：mdx小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa染色可见钙结节沉积,而C57小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边。与C57小鼠比较,mdx小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调（P〈0.05）,而成肌基因表达下调（P〈0.05）。dystrophin基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx小鼠肌肉组织变性坏死的原因。