含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞.目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell 非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL 和EB/AGM+FL+BM共4 组.共培养6 d 后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态.结果与结论:①EB/AGM+FL 组和EB/AGM+FL+BM 组收获细胞涂片均发现原始造血细胞.②拟胚体来源细胞经AGM 区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05).③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高.提示AGM+FL 和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层.     

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.     

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景：研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的：以人主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros,AGM）区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论：拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞占（13.12±1.30）%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化.目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6 d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性.再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Co γ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组.结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%.NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成.静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21 d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因.提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力.     

红细胞生成素基因修饰的间充质干细胞条件培养基促进人胚胎干细胞向造血细胞分化

本研究探讨EPO基因修饰的间充质干细胞条件培养液对人胚胎干细胞向造血细胞诱导分化的影响。通过重组慢病毒系统感染人间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）,建立能够稳定高效表达红细胞生成素（erythropoietin,EPO）的细胞株EPO／MSC。用EB培养液诱导人胚胎干细胞形成拟胚体,然后用EPO／MSC条件培养液处理拟胚体细胞;通过免疫荧光、集落形成实验和RT—PCR检测等方法对诱导的细胞进行了相关鉴定。结果表明：EPO／MSC体外能够稳定表达EPO。条件培养液诱导生成的细胞表达造血干／祖细胞抗原CD34和相关造血基因,可产生不同的造血集落,且明显高于对照组。结论：EPO基因修饰的间充质干细胞条件培养液能显著促进人胚胎干细胞向造血细胞分化。     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

不同发育阶段拟胚体对小鼠胚胎干细胞造血分化的影响

目的 通过对拟胚体(Embryoid body, EB)在造血发育过程中三个不同发育阶段的初步探讨,以了解它们对胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)造血分化的影响.方法 根据不同阶段拟胚体的发育特点,将拟胚体分为三个阶段:EB 3-5天、EB 6-8天以及EB 9-13天.通过形态学、流式细胞仪分析、Realtime PCR以及造血集落形成试验来分析不同阶段拟胚体在造血分化过程的特点.结果 EB培养至第5天、第7天、第10天时,每6000个ES细胞形成EB的数量分别是97、100、88个;流式细胞仪检测CD34+/Sca-1+细胞,结果分别是8.91%、9.23%、12.73%;Realtime PCR结果分别显示EB培养到第6天左右时中胚层发育最为活跃,第10天时造血发育比前两个阶段要活跃;造血集落形成试验显示EB发育至第5天、第7天以及第10天时,每1×105个EB细胞形成的集落数分别是21、26、32.结论 EB 3-5天处于分化早期,各种检测参数数值都相对比较低,适合于次级拟胚体以及爆发集落的培养;EB 6-8天中胚层发育最为活跃;EB 9-13天造血发育相对比较成熟.根据不同阶段拟胚体发育的特点,可以选择适当的拟胚体作为体外造血分化模型来满足不同研究目的 需要.     

体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子

本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞表达的造血生长因子，为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料。采用RT—PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Fit3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞（hAGMSI—S5）的表达情况，应用ELISA法测定IL-6、SCF、Fit3-L在hAGMSI—S5细胞培养上清液中的分泌水平，并将脐血CD34^＋细胞与hAGMSI—S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用。结果表明：hAGMSI—S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMSI—S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Fit3-L、IL-6等因子，hAGMSI—S5组间比较各因子水平无显著性差异（P〉0．05）。集落培养结果表明，hAGMSI—S5对CFU—GM、BFU—E、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用，hAGMSI—S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异（P〈0.05），其中hAGMS3,S4优于S1、S2及S5。结论：人AGM区基质细胞表达SCF、Fit3-L、IL-6、OSM等多种造血生长因子，这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关。     

人胚AGM区造血干／祖细胞的分离及其在含AGM区基质细胞体系中的培养

本研究分离人胚主动脉-性腺-中肾（AGM）区造血干／祖细胞（HSPC）并在含人AGM区基质细胞的培养体系中进行培养，以了解人AGM区基质细胞对HSPC的作用。以免疫组织化学方法检测人胎龄28—45天胚胎AGM区细胞CD34、Flk-1、VEGF的表达；分离AGM来源的HSPC，通过直接接种和经Transwell非直接接触两种方法接种于含人AGM区基质细胞系（hAGMS3和hAGMS4）饲养层的培养体系，观察HSPC生长情况和卵石区形成细胞（cobblestone area—forming cells，CAFC）并计数卵石区（cobblastone area，CA）；用间接免疫荧光方法检测培养体系中悬浮细胞和CAFC的cD34、Flk-1表达；收获细胞进行半固体造血集落培养以检测两种培养方法对AGM—HSPC的集落形成能力影响。结果表明：人AGM区造血细胞表达cD34和Flk-1。两种接种方法均显示有CFC形成，直接接触培养能形成CD34和Flk-1双阳性的CAFC，集落总数明显高于非接触培养（hAGMS3体系：1647-1-194VS389-1-31．P〈0．05；hAGMs4体系：1586±75VS432±35，P〈0．05）。结论：①人胚AGM区含有CD34^＋Flk-1^＋的HSC。②首次建立含人胚AGM基质细胞的AGM—HSPC培养体系，直接接触培养和非直接接触培养均能促进AGM—HSC的生长，AGM基质细胞与HSC直接接触发挥重要作用。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

间充质干细胞和内皮祖细胞对脐血造血干/祖细胞体外扩增效力的影响

目的比较脐带来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)和内皮祖细胞(Endothelial progeni-tor cells,EPCs)对脐血造血干/祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells,HSCs/HPCs)的体外扩增效力。方法正常人脐血中分离单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),流式细胞术检测其中HSCs/HPCs所占比例,将MNCs分别接种于处理后的MSCs或EPCs或仅接种于培养液中,比较不同培养条件对HSCs/HPCs扩增能力、表面抗原CD34的表达以及集落形成能力的影响。结果共培养过程中,MSC组和EPC组的MNCs扩增倍数均明显高于对照组,且EPC组更为显著。扩增7天后,对照组、MSC组和EPC组的HSCs/HPCs CD34的表达均较扩增前下降,其中EPC组下降的最为显著,MSC组最不显著。共培养4天后,MSC组的HSCs/HPCs集落形成总数为EPC组的2.47倍(**,P<0.01),共培养7天后,MSC组的HSCs/HPCs集落形成总数为EPC组的3.45倍(**,P<0.01);EPC组与对照组的HSCs/HPCs集落形成总数无显著性差异。结论 MSC和EPC均可为HSCs/HPCs的体外扩增提供适宜的微环境,MSC可抑制HSCs/HPCs的分化,有助于维持其表面抗原CD34的表达,并保持其造血重建潜能和归巢能力;而EPC则可有效促进HSCs/HPCs的分化。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

丹参素对小鼠外周血造血干细胞动员作用的研究

目的:探讨丹参素对小鼠外周血造血干细胞的动员作用及其对小鼠外周血细胞和骨髓基质细胞黏附分子的影响。方法:30只BALB/c小鼠随机分为三组:丹参素组、G-CSF组、生理盐水组,腹腔注射d1～d7,每日1次,第2～8天,采用外周血WBC和MNC计数、流式细胞术、造血祖细胞体外培养、免疫细胞化学等检测各组给药后对外周血WBC、MNC、CD34+细胞、CD49d阳性细胞、CFU-GM、CFU-MK、CFU-E的产率及小鼠骨髓基质细胞VCAM-1阳性细胞百分率的影响。结果:丹参素组给药第7天外周血WBC、MNC数量达到高峰,分别为给药前的3倍和3.5倍;丹参素组外周血CD34+、CD49d阳性细胞及骨髓基质细胞VCAM-1阳性细胞百分率分别为(1.03±0.24)%、(12.59±2.64)%和(50.86±8.77)%,均明显高于生理盐水组(P<0.05);其CFU-GM、CFU-MK和CFU-E产率分别为(14.90±2.88)%、(12.50±4.06)%和(16.10±6.36)%,均明显高于生理盐水组(P<0.01)。结论:丹参素对小鼠外周血造血干细胞有一定的动员作用,且这一作用可能与其上调小鼠外周血细胞和骨髓基质细胞黏附分子的表达有关。     

同基因造血干细胞移植免疫重建诱导小鼠皮肤移植耐受

背景：器官移植耐受的最佳效果是能够诱导对移植抗原的特异性免疫耐受。目的：探讨小鼠异基因皮肤移植后,通过受体同基因造血干细胞移植重建免疫系统诱导移植皮肤免疫耐受的可行性。方法：取BALB/c小鼠骨髓。以C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体,进行异基因皮肤移植;32只受体鼠随机均分为4组：移植对照组、环孢素A组、照射组和骨髓移植组。结果与结论：照射组小鼠10d内全部死亡,外周血白细胞数呈持续性降低;而骨髓移植组小鼠长期存活,白细胞数全身照射后6d降到最低,之后持续性增高,照射后21d与环孢素A组比较差异无显著性意义（P〉0.05）,移植皮肤存活时间显著长于其他各组（P〈0.01）,其淋巴细胞浸润及组织结构破坏明显减少,小鼠脾细胞对供体小鼠脾细胞增殖反应显著降低。说明同基因骨髓细胞移植重建免疫系统可显著延长小鼠移植皮肤存活时间,可诱导供者特异性免疫耐受。