脱细胞天然骨基质与诱导性成骨细胞的体外相容性

背景:前期工作表明TritonX-100处理的脱细胞骨基质已满足组织学和免疫学方面的修复要求。如果细胞能在材料表面很好地生长,将利于进一步进行体内动物实验。目的:采用细胞培养法在体外评估脱细胞骨基质与诱导后成骨细胞的生物相容性。方法:第3代骨髓基质干细胞经成骨诱导分化培养液诱导分化为成骨细胞,接种于TritonX-100处理的脱细胞骨基质及羟基磷灰石表面,检测成骨细胞的碱性磷酸酶表达并用扫描电镜观察材料表面的细胞生长情况。结果与结论:碱性磷酸酶活性分析均表明,TritonX-100处理的脱细胞骨基质在培养48h之后比羟基磷灰石更利于诱导成骨细胞生长;扫描电镜下可见,成骨细胞在脱细胞骨基质表面呈现立体生长方式,细胞呈球形,并且聚集成簇。体外实验结果显示成骨细胞与脱细胞天然骨基质有较好的生物相容性。     

成骨诱导人脐带间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架材料的生物相容性

背景:纳米羟基磷灰石/聚酰胺66材料有利于成骨细胞的长入和新生骨的形成、且抗弯强度、抗压强度等各项参数与正常骨组织的力学性能相接近,能满足实验动物硬组织修复的要求.目的:分析成骨诱导后人脐带间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合支架的生物相容性.方法:体外培养人脐带间充质干细胞,纯化增殖,成骨诱导.取成骨诱导后的第3代人脐带间充质干细胞接种于纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架材料上,观察细胞的生长、增殖情况及材料细胞毒性.结果与结论:成骨诱导后人脐带间充质干细胞在复合支架上生长分化良好,增殖活性不受材料影响.成骨诱导14 d内,可见碱性磷酸酶活性随着培养时间延长而逐渐增高.MTT法检测细胞无毒性.扫描电镜观察,1 d后可见细胞在支架表面附着生长;7 d后可见细胞在材料上生长良好,材料空隙有大量充填.说明纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架可作为骨组织工程中人脐带间充质干细胞的细胞载体,具有良好的生物相容性,能满足骨组织工程的需要.     

纳米级二氧化锆增韧羟基磷灰石生物复合陶瓷对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

背景：课题组拟对纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石生物陶瓷进行一些初步研究,主要集中在生物力学匹配性,化学稳定性,以及生物相容性实验,其中体外细胞培养实验具有可控性,可重复性,能很好地反映材料的生物相容性。目的：比较纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石两种材料对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法：将骨髓基质干细胞置于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基中培养,传代后改用含β-甘油磷酸钠,地塞米松和维生素C的条件培养基培养。取传至第3代的成骨细胞,以1.0×108L-1浓度接种于放有材料块的细胞培养板中,培养第1~10天倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线,并进行碱性磷酸酶活性检测。培养第6天的细胞和材料复合物用多聚甲醛固定进行扫描电镜观察。结果与结论：MTT法测得两种材料培养的细胞生长曲线无显著差异。复合培养的兔骨髓基质干细胞能够保持正常分泌碱性磷酸酶的功能。电镜照片也同样证实了两种材料表面均有细胞的附着。说明纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石均不影响成骨细胞增长分化,具有优良的成骨细胞相容性。     

纳米材料复合人骨髓成骨细胞培养的研究

目的　探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法　分离培养人骨髓间充质干细胞 ,诱导为成骨细胞后作为种子细胞 ,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料体外联合培养 ,通过对复合物光镜及扫描电镜观察 ,了解细胞在材料中生长情况。结果　人骨髓间充质干细胞可以诱导为成骨细胞 ,体外复合培养 2周 ,分布于支架材料上的细胞大量分化增殖。结论　纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种构建组织工程骨的较好的支架材料     

胶原-纳米羟基磷灰石复合支架的细胞相容性

背景：观察成骨细胞在生物材料上的形态、增殖和分化等项目,可评估生物支架材料的生物相容性。目的：观察复合支架材料纳米羟基磷灰石/胶原对成骨细胞增殖、分化的影响。方法：取新生24h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养,取第3代细胞与纳米羟基磷灰石/胶原支架或普通羟基磷灰石材料体外复合培养。培养3,6,9d后,观察材料周边的细胞形态及支架材料对细胞分化、增殖的影响。结果与结论：纳米羟基磷灰石/胶原材料较普通的羟基磷灰石材料更有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,证实其生物相容性更好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。     

珊瑚羟基磷灰石，骨形态发生蛋白复合骨组织工程细胞支架的生物相容性

背景:理想的骨细胞支架材料除具有良好的生物相容性外,还能促进细胞的增殖和分化,诱导骨组织再生,各种细胞支架材料单独使用时的成骨能力是有限的。目的:观察复合有骨形态发生蛋白的珊瑚羟基磷灰石与成骨细胞的生物相容性。设计:对比观察。材料:珊瑚羟基磷灰石/骨形态发生蛋白、珊瑚羟基磷灰石,将其分别切割成4mm×4mm×3mm和10mm×10mm×3mm大小块状物,高压灭菌后,完全培养基浸泡4d后备用。方法:实验于2005-03/08在广州军区广州总医院中心实验室完成。①取新西兰大白兔骨髓成骨细胞培养。②将成骨细胞分别和珊瑚羟基磷灰石/骨形态发生蛋白(复合珊瑚羟基磷灰石组)、珊瑚羟基磷灰石(单纯珊瑚羟基磷灰石组)混合培养,并设空白对照。③混合培养后2,4,6,8d分别检测细胞增殖指数和碱性磷酸酶活性。主要观察指标:①成骨细胞相差显微镜观察结果。②复合珊瑚羟基磷灰石材料扫描电镜观察结果。③各组细胞碱性磷酸酶活性测定。④各组细胞增殖指数测定。结果:①成骨细胞相差显微镜观察结果:细胞呈梭形、扁圆形及多角形外观,有数量不等、长短及粗细不一的突起,细胞通过突起相互间接触。②复合珊瑚羟基磷灰石材料扫描电镜观察结果:材料表面呈颗粒状,具有微孔。成骨细胞在材料表面贴壁生长,初为单层,随着细胞的进一步分化、增殖,细胞开始叠层生长,细胞周围出现高密度颗粒,排列方式绝大多数呈一定取向,随着钙盐结晶的增多,最终形成骨结节。细胞被包埋在基质中。③各组细胞碱性磷酸酶活性测定显示:混合培养后2,4,6,8d复合珊瑚羟基磷灰石组的碱性磷酸酶活性(A值)明显高于单纯珊瑚羟基磷灰石组和对照组(4d:101.6±7.7,93.7±6.8,94.4±5.0;8d:120.1±8.2,108.3±8.8,110.4±7.5;P<0.01或0.05)。单纯珊瑚羟基磷灰石组与对照组比较差异不明显。④各组细胞增殖指数测定显示:随着时间的延长,两组的细胞增殖指数均有所增加,但相互间差异不明显。结论:复合珊瑚羟基磷灰石内部呈珊瑚状,微孔数量多,细胞在其表面附着良好,具有很好的生物相容性,另外由于其复合了骨形态蛋白可以增强细胞碱性磷酸酶活性,故有一定的骨诱导作用。     

纳米级二氧化锆增韧羟基磷灰石生物复合陶瓷对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

背景:课题组拟对纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石生物陶瓷进行一些初步研究,主要集中在生物力学匹配性,化学稳定性,以及生物相容性实验,其中体外细胞培养实验具有可控性,可重复性,能很好地反映材料的生物相容性。目的:比较纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石两种材料对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法:将骨髓基质干细胞置于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基中培养,传代后改用含β-甘油磷酸钠,地塞米松和维生素C的条件培养基培养。取传至第3代的成骨细胞,以1.0×108L-1浓度接种于放有材料块的细胞培养板中,培养第1~10天倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线,并进行碱性磷酸酶活性检测。培养第6天的细胞和材料复合物用多聚甲醛固定进行扫描电镜观察。结果与结论:MTT法测得两种材料培养的细胞生长曲线无显著差异。复合培养的兔骨髓基质干细胞能够保持正常分泌碱性磷酸酶的功能。电镜照片也同样证实了两种材料表面均有细胞的附着。说明纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石均不影响成骨细胞增长分化,具有优良的成骨细胞相容性。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

改性纳米羟基磷灰石表面性质及对成骨细胞贴壁生长的影响

背景：生物材料表面性质的改变能够影响其与细胞的相互作用,并进一步影响细胞黏附能力、基因表达等行为。目的：评价改性纳米羟基磷灰石的表面性质及其对成骨细胞在材料表面黏附能力的影响。方法：参考作者既往实验制备纳米羟基磷灰石和改性纳米羟基磷灰石,利用zeta电位仪测定改性纳米羟基磷灰石的zeta电位,通过测定水在改性羟基磷灰石表面的接触角,结合成骨细胞黏附试验,分析表面改性对材料的细胞黏附能力和生物相容性的影响。结果与结论：改性纳米羟基磷灰石表面呈疏水性,接触角为93°,成骨细胞黏附实验表明,改性纳米羟基磷灰石表面比纳米羟基磷灰石表面黏附更多的成骨细胞,表明表面改性增强了纳米羟基磷灰石的生物相容性。     

去除移植免疫反应抗原成分脱细胞天然骨基质的制备

背景：同种异体骨来源广泛,便于大量加工贮存,如能去除其免疫排斥反应用于骨支架修复骨缺损,将很好地解决骨源问题,但目前去除免疫排斥的方法不尽理想。目的：运用低渗-脱细胞联合过氧化氢去除骨基质中引起免疫排斥反应的抗原成分。方法：将SD大鼠股骨经低渗-脱细胞、过氧化氢处理制备天然脱细胞基质,再通过苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色、扫描电镜与透射电镜观察、有机成分分析、洗脱剂残留量测定和移植免疫分析方法评估处理效果,并与新鲜大鼠股骨标本作比较。结果与结论：组织学观察可见处理后的脱细胞骨基质中胶原纤维排列规则,骨陷窝空虚,未见细胞,纤维连接蛋白和层粘连蛋白多存留在骨陷窝周边部。扫描电镜观察见处理后的骨基质板层连接疏松,板层之间出现大量孔隙;透射电镜见骨陷窝区已无高密度影;高效液相色谱仪检测TritonX-100在脱细胞骨基质中几无残留。光镜及扫描电镜均可见新鲜骨中有大量细胞成分。淋巴细胞刺激实验表明新鲜骨引起的免疫排斥反应明显强于脱细胞骨基质（P 〈 0.01）。说明联合应用低渗-脱细胞和过氧化氢处理基质的方法去除免疫排斥反应较为理想。     

新型脱细胞骨基质材料的制备及理化评估

背景：传统的结构性天然骨脱细胞的方法存在许多不足之处。目的：用新的理化方法对结构性骨块进行脱细胞处理制作新型骨支架材料的可行性,并检测其理化性能。方法：以股骨头负重区结构性骨块为原料,高压水枪冲洗,继而利用Triton-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞等理化处理,制备新型脱细胞骨基质材料,并对支架进行大体、组织学、扫描电镜、Micro-CT观察、生物力学等相关检测。结果与结论：新型脱细胞骨基质材料保留了骨的细胞外基质成分,脱细胞彻底,扫描电镜及Micro-CT观察显示支架具备三维多孔网状结构系统,具有天然骨的孔径和孔隙率;生物力学测试脱细胞组支架的弹性模量为（552.56±58.92）MPa,强度为（11.34±3.49）MPa,与新鲜骨的弹性模量及强度比较,差异无显著性意义（P〉0.05）,可作为骨组织工程支架的良好载体。     

引导种植牙区骨再生的异种脱细胞真皮基质

背景：异种脱细胞真皮基质属于口腔修复膜材料,因具有良好的生物相容性而被广泛应用。目的：评价异种脱细胞真皮基质在牙区引导牙种植骨再生的效果。方法：以免疫组化染色后显微镜观察异种脱细胞真皮基质的显微结构和细胞相容性,评价应用在引导骨再生技术中的可能性。对应用异种脱细胞真皮基质引导骨再生的牙种植修复患者进行观察随访,评价成骨效果以及对缺损软组织的影响,并与Bio-Gide生物膜以及博特医用胶原膜等其它修复膜引导骨再生的效果进行比较。结果与结论：异种脱细胞真皮基质的显微结构显示其有基底膜面和组织面,基底膜面可见指突结构和毛囊孔,组织面为鳞片状结构,对成骨样细胞的增殖活力和碱性磷酸酶的活性无影响,具有良好的细胞相容性。临床研究显示在牙种植中应用异种脱细胞真皮基质引导骨再生能够获得良好的骨再生效果,与Bio-Gide生物膜以及博特医用胶原膜引导骨再生的效果无明显差异,并且用于修复骨增量后软组织的不足同样能够获得较好的骨再生效果。     

兔膀胱脱细胞基质负载大鼠毛囊干细胞的体外培养

背景：组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的修复和重建开辟了新的途径,膀胱脱细胞基质是较好的泌尿系组织工程修复的替代材料。目的：构建毛囊干细胞与异种膀胱脱细胞基质为支架的细胞支架复合物,体外培养观察细胞在支架上的生长状态。方法：制备新西兰兔膀胱脱细胞基质,通过扫描电镜和Masson染色检测材料脱细胞效果,采用二次沉淀法将第3代毛囊干细胞静态接种于膀胱脱细胞基质表面,倒置显微镜下观察细胞生长状态,并绘制细胞生长曲线,组织学检测和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况。结果与结论：制备的膀胱脱细胞基质为白色半透明膜状,扫描电镜下观察为纤维网状结构,未见细胞残留。Masson染色提示膀胱脱细胞基质为胶原结构,无明显细胞残留。细胞材料体外复合培养48 h后倒置显微镜下观察膀胱脱细胞基质周围毛囊干细胞生长状态良好,1周后扫描电镜下观察毛囊干细胞伸展、黏附于支架表面。结果可见毛囊干细胞与膀胱脱细胞基质体外培养具有良好的生物相容性。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μm,孔隙率（65.23±7.35）%。复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

三种不同方法制备去细胞神经支架的比较

背景：去细胞异体神经移植物具有完全仿真的三维结构,为细胞附着提供了较理想的三维空间,是目前所有人工合成材料所无法比拟的。目的：对比分析液氮冷冻法、化学法及改良法3种方法对大鼠坐骨神经去细胞化的优劣。方法：切取SD大鼠10mm坐骨神经,分别以液氮冻融法、TritonX-100处理化学去细胞法、改良法处理的化学去细胞法分别制作去细胞神经支架,行苏木精-伊红染色,并在扫描电镜下观察支架超微结构。结果与结论：液氮冻融法去细胞支架内有较多许旺细胞残留,有较多轴突及髓鞘,基膜完整,基膜管欠通畅;TritonX-100处理化学法去细胞神经支架内无明显许旺细胞,管内未见明显轴突及髓鞘残留,基膜完整,基膜管通畅;改良法处理的化学去细胞神经支架内许旺细胞及轴突、髓鞘成分几乎完全消失,去细胞效果更好,基膜完整,基膜管更通畅。表明TritonX-100处理化学去细胞法、改良法处理的化学去细胞法脱细胞效果较好,其中以改良法处理的化学去细胞法最好。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

新型脱细胞骨基质材料的制备及理化评估

背景:传统的结构性天然骨脱细胞的方法存在许多不足之处.目的:用新的理化方法对结构性骨块进行脱细胞处理制作新型骨支架材料的可行性,并检测其理化性能.方法:以股骨头负重区结构性骨块为原料,高压水枪冲洗,继而利用Triton-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞等理化处理,制备新型脱细胞骨基质材料,并对支架进行大体、组织学、扫描电镜、Micro-CT观察、生物力学等相关检测.结果与结论:新型脱细胞骨基质材料保留了骨的细胞外基质成分,脱细胞彻底,扫描电镜及Micro-CT观察显示支架具备三维多孔网状结构系统,具有天然骨的孔径和孔隙率;生物力学测试脱细胞组支架的弹性模量为(552.56±58.92) MPa,强度为(11.34±3.49) MPa,与新鲜骨的弹性模量及强度比较,差异无显著性意义(P > 0.05),可作为骨组织工程支架的良好载体.