P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响

背景:5-氮杂胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学试剂.目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为4组,即正常对照组、5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组.观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,MTT法测定诱导后各组骨髓间充质干细胞增殖能力,以流式细胞仪检测诱导后各组细胞凋亡率,采用Western blot法测定诱导后P53、P21蛋白表达情况.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致.骨髓间充质干细胞表面抗原CD44,CD45阳性表达率分别为(89.98±1.29)%,(2.14±0.22)%.MTT结果显示,当PFT-α浓度≤20 μmol/L时,对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用;而当其浓度达到40 μmol/L时,PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖.培养第5,7天时,与其他3组比较,5-氮杂胞苷组对骨髓间充质干细胞增殖表现出明显抑制(P < 0.01).流式细胞仪结果显示,5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞凋亡率显著高于其他3组(P < 0.01).Western blot结果显示,各组均有P53、P21蛋白的表达,以5-氮杂胞苷组表达量明显增多.提示通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡,促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖.     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的研究

目的:探讨应用5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向肌样细胞分化的可能性。方法:从1周龄SD大鼠骨髓提取分离BMSCs,在体外培养增殖,并采用流式细胞仪鉴定。以5-氮杂胞苷作用于BMSCs,诱导其向肌样细胞分化,继续培养3周后,采用苏木精-伊红、结蛋白、α-横纹肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SMA)免疫组织化学染色观察BMSCs的分化情况。结果:从1周龄大鼠四肢长骨中提取骨髓,经贴壁法分离,传代后用流式细胞仪检测细胞表面抗体,结果显示CD29、CD105呈阳性,CD34、CD45呈阴性反应,P2、P3代BMSCs的比例明显提高。经诱导的细胞结蛋白、α-SMA染色呈强阳性。结论:在体外经5-氮杂胞苷诱导的BMSCs可向肌样细胞分化。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:目前在5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化领域中,对用于诱导的细胞代次选择不一。实验选择第2,9代骨髓间充质干细胞,观察比较经5-氮胞苷体外诱导后其各自向心肌细胞分化过程中心肌特异性肌钙蛋白cTnT和早期分化基因的表达。方法:实验于2005-07/2007-07在天津中医药大学病理三级实验室完成。①实验方法:清洁级Wistar雄性大鼠,脱颈处死后取双侧股骨、胫骨,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞进行原代培养。去掉原代细胞瓶内的培养液,D-Hank’s液冲洗去除血清,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸消化,制备单细胞悬液,按1∶3传代。用10μmol/L的5-氮胞苷分别诱导第2,9代骨髓间充质干细胞,诱导4周,并设立未加诱导剂的阴性对照。②实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化;免疫组织细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达,胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性;嵌合荧光法检测心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量。结果:①细胞形态学观察:5-氮胞苷诱导前细胞生长较快,诱导后死亡细胞较多且生长较慢。诱导后2,3,4周,第9代骨髓间充质干细胞无论在形态和细胞活力方面均优于第2代。②心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达:5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌特异性肌钙蛋白cTnT阳性表达率明显高于第2代(22.42±9.97),(11.22±5.62)%,P<0.05,阴性对照无阳性表达。③心肌早期基因的表达:反转录-聚合酶链反应结果显示,5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量均明显高于第2代(P<0.05)。结论:经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT及4种心肌早期基因,证实其能够向心肌细胞分化,且传至第9代时向心肌细胞分化的能力要强于第2代。     

经5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞心肌移植对心功能的影响

背景:骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,但其在体外经5-氮胞苷诱导后移植于急性心肌梗死大鼠中,能否改善近期及远期的心功能,目前尚不明确.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后对心功能的影响.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,5-氮胞苷诱导4周后,体外DAPI标记.新西兰兔随机均分3组,假手术组:打开胸腔1 h后缝合胸腔;骨髓间充质干细胞组:于冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射诱导后的自体骨髓间充质干细胞;急性心肌梗死组:造模后于相同部位注射等量生理盐水.移植后3 d,4周超声心动图检测各组大鼠左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数变化.结果与结论:荧光显微镜观察发现,骨髓间充质干细胞组移植后3 d,4周心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞,呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行.移植后3 d,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数无明显差异,心功能没有明显的改善;移植4周后,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,射血分数明显提高,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显降低.     

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的：观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α＋5-氮杂胞苷组。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷＋PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。     

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α+5-氮杂胞苷组。结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。     

成肌分化因子和5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞的分化

背景: 传统治疗肌组织缺损的方法是肌肉转位替代疗法,这样就造成了另一块肌组织的损伤.在这种背景下,作者设计了该课题,寻找肌肉原位修复的方法.目的: 探讨大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为骨骼肌细胞的条件.方法: 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,应用5一氮杂胞苷、成肌分化因子、转化生长因子β1、胰岛索样生长因子1联合进行诱导,使之分化.在诱导后的第9天,收集细胞,免疫组织化学法对细胞进行鉴定.结果与结论: 原代培养的骨髓间充质干细胞呈贴壁、集落样生长,5～7 d后有多突成纤维细胞、扁平多角形细胞、多角形细胞和三角形细胞.12 d后,见细胞融合,铺满瓶底,骨髓间充质干细胞的形态变化不明显.经5-氮杂胞苷诱导后细胞,起初部分细胞死亡,生长缓慢.7 d后见细胞明显生长,体积逐渐增大,呈椭圆形、梭形或不规则形状.14 d后,大量增殖的长梭形细胞开始增多.18～22 d后,肌管数量增多,体积增大,核数亦明显增多,初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列,间隔分布.骨髓间充质/干细胞免疫组化法测定见CD44反应阳性,胞质呈棕褐颗粒,核周明显,CD34呈阴性反应.诱导后骨髓间充质干细胞免疫组化法测定见结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达.结果提示在体外,成肌分化因子和5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞定向分化,并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达.     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的：以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法：采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论：诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加（P〈0.05）。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

"心肌样"环境下5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞分化的实验研究

目的 研究在"心肌样"环境下5-氮胞苷(5-Aza)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的有效性.方法 ①分离和纯化大鼠BMSCs,用5-Aza诱导部分BMSCs,组1不用5-Aza诱导,取第3代细胞进行下一步试验;组2于原代培养第3天加入5-Aza(10 μmol/L)诱导24 h;组3在第3代细胞接近融合前24 h加入5-Aza(10 μmol/L)诱导24 h;组4于原代培养第3天加入5-Aza(10μmol/L)诱导24 h,在第3代细胞接近融合前24 h加入5-Aza(10 μmol/L)再次诱导24 h;并用流式细胞仪鉴定.②BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养("心肌样"环境).③免疫荧光法检测BMSCs的肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)表达.结果 ①各组的BMSCs形态基本相同,流式细胞仪鉴定CD29、CD44为阳性.而CD34阴性.②免疫荧光结果 显示5-Aza单次诱导组(组3)与未诱导组(组1)比较MHC[(6.82±2.05)%与(3.61±1.14)%]、cTnI[(5.63±1.86)%与(2.76±0.82)%]阳性率显著增加(P均<0.05);且5-Aza双次诱导组(组4)较单次诱导组(组3)MHC[(12.18±3.16)%与(6.82±2.05)%]、cTnI[(9.93±2.79)%与(5.63±1.86)%]阳性率显著增加(P均<0.05).结论 "心肌样"环境下5-Aza能够明显促进BMSCs向心肌样细胞分化,且双次诱导较单次诱导效果更好.     

“心肌样”环境下5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞分化的实验研究

目的研究在“心肌样”环境下5-氮胞苷（5-Aza）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的有效性。方法①分离和纯化大鼠BMSCs,用5-Aza诱导部分BMSCs,组1不用5-Aza诱导。取第3代细胞进行下一步试验;组2于原代培养第3天加入5-Aza（10μmol／L）诱导24h;组3在第3代细胞接近融合前24h加入5-Aza（10μmol／L）诱导24h;组4于原代培养第3天加入5-Aza（10μmol／L）诱导24h,在第3代细胞接近融合前24h加入5-Aza（10μmol／L）再次诱导24h;并用流式细胞仪鉴定。②BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养（“心肌样”环境）。③免疫荧光法检测BMSCs的肌球蛋白重链（MHC）和心肌特异性肌钙蛋白I（cTnI）表达。结果①各组的BMSCs形态基本相同,流式细胞仪鉴定CD29、CIM4为阳性,而CD34阴性。②免疫荧光结果显示5-Aza单次诱导组（组3）与未诱导组（组1）比较MHC[（6．82±2．05）％与（3．61±1．14）％]、cTnI[（5．63±1．86）％与（2．76±0．82）％]阳性率显著增加（P均〈0．05）;且5-Aza双次诱导组（组4）较单次诱导组（组3）MHC[（12．18±3．16）％与（6．82±2．05）％]、cTnI[（9．93±2．79）％与（5．63±1．86）％]阳性率显著增加（P均〈0．05）。结论“心肌样”环境下5-Aza能够明显促进BMSCs向心肌样细胞分化,且双次诱导较单次诱导效果更好。     

化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

背景:研究显示干细胞有随环境发生分化即"环境依赖性分化"的特性,但骨髓间充质干细胞在心肌组织是否存在此种特性目前尚未形成公识.目的:观察化学诱导剂和模拟的生物微环境诱导对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外对比观察,于2008-01/2009-02在苏州大学心血管内科干细胞移植实验室完成.材料:6～8周龄SD大鼠,用于骨髓间充质干细胞的培养;新生1～3 d同种系SD大鼠,用于心肌细胞的培养.方法:取SD大鼠股骨骨髓,培养至第2代,经流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度97%以上,制成4×108L-1的细胞悬液,实验分为4组:单纯DMEM培养组:用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养;5-氮杂胞苷组:24 h后培养液内加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷;心肌细胞裂解液组:将4倍于骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞裂解液加入骨髓间充质干细胞培养瓶中;间接接触组:在培养体系中放入millicell插入式细胞培养皿,28 d收获细胞.主要观察指标:免疫组织化学法检测诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、CD31的情况;RT-PCR法检测各组早期心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、β-肌球蛋白重链及α-肌球蛋白重链基因的表达情况.结果:免疫组织化学检测显示实验组诱导4周后特异性抗原呈阳性表达,实验组与单纯DMEM培养组相比,差异有显著性意义(P<0.05);间接接触组较心肌细胞裂解液组阳性细胞数目稍增多,但组间差异无显著性意义(P>0.05);CD31是血管内皮细胞的表面抗原标志,单纯DMEM培养组和5-氮杂胞苷组无表达,其他两组弱阳性表达,组间差异无显著性意义(P>0.05).实验组诱导4周后,均表达心肌前体细胞特异性转录因子NKX-2.5和GATA4,同时表达胚胎期占优势的心肌细胞特异性β-肌球蛋白重链,而没有表达成年期占优势的心肌细胞特异性标志α-肌球蛋白重链.结论:5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,心肌细胞裂解液和细胞间接接触模拟的心肌微环境也可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞,分化的细胞介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体.     

牵拉应力在5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞成肌过程中的动态效应

背景:国内外研究发现在一定力学环境下,体外培养的间充质干细胞其增殖分化等一系列生物学特性会发生相应变化.目的:体外观察5-氮杂胞苷与牵拉应力对大鼠骨髓间充质干细胞向肌细胞分化的调控作用.设计、时间及地点:2006-01/2007-06在上海交通大学牛物力学实验室完成的细胞观察实验.材料:清洁级3-4周龄雄性SD大鼠30只用于分离培养骨髓间充质干细胞,1～3d龄SD新生鼠4只用于建立骨骼肌阳性细胞株.化学诱导剂5-氮杂胞苷为Sigma公司产品,牵拉设备Fx-4000 Flexercell由美国Flexcell Int公司生产.方法:将传至第4代的骨髓间充质干细胞接种于Flex 6孔板.[1]设立5组行成肌家族因子表达Western-Blot检测:第1组细胞单纯经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周;第2～4组细胞以10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1周后,在1Hz频率、15%幅度应力条件下分别牵拉12,24,36h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.[2]设立5组行诱导剂及牵拉应力作用的RT-PCR检测:第1组细胞给予1Hz频率、15%幅度应力牵拉24h;第2、3组分别经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导1,2周;第4组细胞经10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导2周后,给与同等应力牵拉24h;第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照.主要观察指标:不同诱导条件及应力牵拉状态下骨髓间充质干细胞成肌家族因子的表达.结果:[1]第1组表达成肌因子MyoD与Myf5,成熟肌细胞标志MHC表达不显著;第2～4组MyoD与Myf5的表达明显增强(P<0.05),且随牵拉时间延长因子的表达逐步增强,MHC表达不显著.[2]第1组不表达成肌家族因子;第2组表达MyoD、 Myf5,第3组表达MyoD、 Myf5、 desmin,第4组几乎表达所有检測的肌细胞特异性标记.结论:经5-氮杂胞苷诱导可启动骨髓间充质干细胞向肌细胞分化,单独的牵拉应力不能诱导成肌.牵拉应力可调控5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞的诱导分化进程,并且与牵拉作用时间成正性相关.     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的：观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2．5基因的表达，从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法：实验于2005—08／2006—05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨，抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞，并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol／L 5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h，于诱导后1，2，3，4周，用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2．5基因表达。结果：①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定，表达CD29，CD44，不表达CD34，CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后，骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化，诱导1周后，细胞体积增大，多呈长梭行，平行排列；诱导2周后，细胞变为短柱状，突起位于两端，相邻细胞的突起紧密接触；诱导3周后，短柱状细胞的突起相互连接，部分细胞可见类肌管样结构；诱导4周后，细胞体积变小，可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构，③诱导组细胞GATA-4和Nkx2．5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性，对照组为阴性，诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论：5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化，其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

5-氮胞苷体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的实验

目的:观察5-氮胞苷在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的情况及GATA-4和Nkx2.5基因的表达,从而确定人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点。方法:实验于2005-08/2006-05在解放军沈阳军区总医院心血管外科和中国医科大学实验技术中心一部完成。取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-氮胞苷对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3,4周,用反转录-聚合酶链反应检测GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:①3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。②以5-氮胞苷诱导培养24h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于两端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。③诱导组细胞GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-氮胞苷可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间。     

P53抑制剂诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究P53特异性抑制剂对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞分为对照组(CON)和P53特异性抑制剂(PFT-α)组。观察骨髓间充质干细胞诱导前后细胞形态变化,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原及诱导后心肌样细胞分化率,免疫荧光法检测诱导后cTnI、CX-43表达,Western Blot法测定诱导后cTnI、P53、P21蛋白表达情况。结果原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性表达率为(89.98±1.29)%,CD45阳性表达率为(2.14±0.22)%。心肌样细胞鉴定结果显示:诱导后1周,空白对照组未见cTnI和CX-43免疫荧光表达,PFT-α组少量表达cTnI和CX-43;诱导后4周时,可见空白对照组少量表达cTnI和CX-43,PFT-α组强表达cTnI和CX-43。WesternBlot检测诱导1周时PFT-α组cTnI表达与对照组比较,有统计学差异(P<0.01)。诱导后4周,PFT-α组cTnI表达与对照组比较,有统计学差异(P<0.01)。两组cTnI表达量4周与1周比较有统计学差异(P<0.05)。诱导1周时,PFT-α组几乎不表达P53蛋白,PFT-α组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。诱导4周时,PFT-α组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。PFT-α组诱导4周时P53、P21表达量与1周时比较均有统计学差异(P<0.05)。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组与空白对照组比较有统计学差异(P<0.01)。结论通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

沉默caspase-3基因影响骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡

背景：缺血缺氧的心肌微环境导致植入的细胞存活率低。目的：观察沉默caspase-3基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和体外缺血缺氧环境下凋亡的影响。方法：构建靶向caspase-3的shRNA重组慢病毒并转染骨髓间充质干细胞为转基因组,以正常细胞组和空载体组做对照,采用MTS法检测各组细胞增殖情况。建立缺血缺氧模型,real-timePCR和免疫组织化学分别检测缺血缺氧环境各组细胞的caspase-3mRNA和蛋白表达水平,应用流式细胞术检测不同缺血缺氧时间点（0,6,12,24,48h）各组细胞的凋亡率。结果与结论：重组慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞,且细胞增殖活性升高（P〈0．05）。缺血缺氧环境下,转基因组细胞caspase-3在mRNA和蛋白表达水平相比对照组下降（P〈0．05）。沉默caspase-3能显著降低骨髓间充质干细胞的凋亡率（P〈0．05）,且随着缺血缺氧时间的延长凋亡率缓慢升高。结果提示,沉默caspase-3能加快骨髓间充质干细胞的生长速度和提高在体外缺血缺氧环境下的抗凋亡能力。