铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析

目的: 揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达,为耐低温品系选育提供分子生物学基础。 方法: 根据已获得的HSP70基因片段序列,采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列。预测其编码蛋白的结构与功能,并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析。 结果: 核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp,包含一完整的1 944 bp的开放阅读框,编码647个氨基酸。氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性。冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。 结论: 首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因,为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础。     

铁皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆铁皮石斛Dendrobium officinale蔗糖合成酶基因并对其表达分析,为研究铁皮石斛多糖合成与蔗糖合成酶活性关系及调控表达提供理论依据.方法:基于GenBank上已知的蔗搪合成酶基因SS同源序列,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛蔗糖合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析.结果:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,该基因cDNA全长2 424 bp,编码807个氨基酸(命名为DOSS1),登录号HQ856835,该基因氨基酸序列与兰科植物Moluara yellow(AF530568)同源性达到95%,与Oncidium goldiana(AF530567)同源性达到90%,与禾本科植物的SS基因同源性在80%以上.并对其进行大肠杆菌原核表达诱导,诱导的工程菌能明显表达出一条相对分子质量约为92×10(3)左右的蛋白质,与理论相对分子质量基本相符.结论:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,并诱导出一条与理论蛋白相对分子质量相符的蛋白条带.     

铁皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆与表达分析

目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）基因（DoPK）,并进行生物信息学分析以及检测基因在不同器官中的表达情况。方法 采用RACE技术获得基因的全长cDNA;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助r实时荧光 (real-time quantitative) PCR (RT-qPCR)分析基因在不同器官中的表达情况。结果 克隆获得DoPK（GenBank注册号KC178572）的cDNA全长1 895 bp,编码一条由511个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为55 040,等电点7.00;DoPK基因与江南卷柏、拟南芥、马铃薯和葡萄等植物的PK基因有71%、86%、89%和91%的相似性;DoPK蛋白包含保守的丙酮酸激酶结构域（21～497）和活性位点（235～247）;DoPK属于胞质型的CYTOSOLIC-1亚类,与单子叶植物亲缘关系较近;DoPK基因为组成型表达,其转录本在石斛茎中的相对表达量较高,为叶中的2.29倍,根中次之,为叶中的1.28倍。结论 克隆了胞质型的铁皮石斛DoPK基因的全长cDNA序列,为进一步研究其在铁皮石斛生长发育中的作用奠定基础。     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

铁皮石斛WRKY5基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Do WRKY5基因,并对生物信息学和表达模式进行分析。方法通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从铁皮石斛中克隆到一个WRKY基因,利用生物信息学工具对其进行分析,并利用荧光定量PCR分析其在铁皮石斛中的组织表达模式及在低温胁迫、脱落酸(ABA)胁迫和蔗糖渗透胁迫下的表达模式。结果获得长1 336 bp的Do WRKY5基因转录因子c DNA全长序列,开放阅读框为834 bp,编码277个氨基酸残基,含有一个WRKY基因保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第II类成员。q RT-PCR分析表明,Do WRKY5基因在铁皮石斛根、茎、叶中均有表达,但在叶中的表达量最高。在不同低温和4℃不同时间诱导处理后,该基因表达量均显著升高,并且该基因在ABA胁迫和蔗糖渗透胁迫下均可被诱导表达。结论 Do WRKY5基因在铁皮石斛应答低温胁迫等多种非生物胁迫中可能起重要的调控作用,为进一步研究铁皮石斛的抗寒机制和抗寒性品种的选育提供基础。     

铁皮石斛DoSRK2E基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛蔗糖非酵解1型相关蛋白激酶2(Sn RK2)家族基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过RT-PCR、RACE克隆铁皮石斛Sn RK2(DoSRK2E)基因c DNA全长,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、结构域、跨膜结构、信号肽及亚细胞定位等;利用DNASTAR和MEGA进行多序列比对和系统发育关系重建分析;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式。结果获得铁皮石斛DoSRK2E基因(GenBank登录号API65110),cDNA全长1 795 bp,包含1个1 086 bp的完整开放阅读框,编码蛋白相对分子质量40 850,等电点4.80,无信号肽和跨膜域,包含1个蛋白激酶结构域、1个ATP结合位点和1个Ser/Thr蛋白激酶活化位点,预测定位在内质网膜上;DoSRK2E蛋白与植物SnRK2蛋白序列高度一致,系统发育位置位于SnRK2亚家族的分支III,与拟南芥At SnRK2.6的亲缘关系最近;DoSRK2E基因在铁皮石斛根中表达量最高,茎中次之,叶中最低。结论首次从珍稀濒危药用植物铁皮石斛中克隆得到SnRK2家族基因DoSRK2E,对其分子特性与组织表达模式进行了分析研究,为进一步揭示该基因在铁皮石斛逆境胁迫中的作用机制提供基础。     

铁皮石斛居群差异的研究(Ⅰ)——植物体形态结构的差异

目的：比较分析广西,贵州,云南三省区的铁皮石斛主要居群形态结构的差异。方法：运用光镜对铁皮石斛茎进行比较解剖。结果：将采集到的我国铁皮石斛主产区的主要居群分为二种类型：F型和H型。F型植株的茎相对短而柔软,具粘性,适宜加工成铁皮枫斗;其中广西西林居群和云南广南居群茎的表皮具有较丰富的蜡质,不具下皮层,横切面上维管束密度小,维管束内外侧纤维群不发达,茎尤为柔软,是加工铁皮枫斗的优质居群。H型植株的茎较长,质地较硬,粘性差,不适宜加工成铁皮枫斗。结论：F型和H型居群铁皮石斛茎的形态结构具有明显差异,弄清铁皮石斛居群差异对指导铁皮石斛的采收、加工以及大面积人工繁殖具有重要意义。     

铁皮石斛功效相关药理作用研究进展

根据中医药古籍中石斛功效的论述,具有“补五脏虚劳赢瘦,强阴益精,久服,厚肠胃,补内绝不足,平胃气…补肾益力,壮筋骨,暖水脏”等功效,该文通过CNKI数据库检索,结合铁皮石斛现代药理学研究和临床应用的文献,总结出铁皮石斛主要有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等方面药理作用,结合健康需求进行深入分析,为铁皮石斛进一步研究与开发提供参考.     

铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析

WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子,在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用。该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长,命名为DoWRKY1,提交GenBank获得登录号KF716131。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA为1 704 bp,其中开放阅读框 (ORF) 1 629 bp,编码1条由542个氨基酸组成的多肽,具有2个WRKY保守结构域,属于WRKY家族第Ⅰ类转录因子。酵母单杂交表明,DoWRKY1可以激活下游报告基因 (His3,Ade2) 的表达,具有转录激活功能,属于转录激活子。半定量RT-PCR显示,DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达。qRT-PCR分析表明,DoWRKY1响应茉莉酸甲酯 (MeJA) 和壳聚糖 (chitosan) 诱导,分别在2 h和1 h,表达量达到最高峰。研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础。     

铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因的分子克隆研究

目的克隆铁皮石斛蛋白磷酸酶(protein phosphatase)2A基因,进行生物信息及表达特征分析。方法运用RACE克隆基因,生物信息学软件进行核酸及蛋白质理化性质、保守结构域、亚细胞定位等分析;用DNAStar 7.0、MEGA 6.0分别进行蛋白序列比对和进化分析。借助定量PCR检测基因表达模式。结果 Do PP2A(Gen Bank注册号KT957552)c DNA 1 410 bp,与其他植物PP2A同源性为89%~94%。ORF编码一条由306个氨基酸组成的肽链,分子量35.19 k D,等电点4.79。推导蛋白含有金属依赖性磷酸酶保守结构域,蛋白不含信号肽或跨膜残基,定位于细胞质。Do PP2A与其他植物的PP2A相比具有高度的保守性,聚在PP2A分子进化树的A组。基因转录本在石斛根和茎中分别为叶中的4.41倍和1.45倍。结论 Do PP2A分子克隆及特征为研究其在铁皮石斛生长发育中的分子功能提供基础。     

铁皮石斛产业发展存在的问题与对策

近年来,随着铁皮石斛产业的不断发展,以产、学、研相结合的产业联盟逐渐形成,在产业急剧扩张的背后,也暴露出很多问题如产业基础研究薄弱、开发产品品种单一,深入研究不足、质量难以保障,产业泡沫逐渐形成,为防止铁皮石斛重蹈“普洱茶”的厄运,笔者认为企业及科研院所应加强基础研究及创新应用、强化政府引导,规范市场运作,保障铁皮石斛质量,从而使铁皮石斛产业健康、可持续发展.     

高效液相色谱法测定铁皮石斛中柚皮素的含量

目的:探寻铁皮石斛中指标性成分,建立指标性成分的含量测定方法,并测定浙江省不同种植基地、不同生长年限铁皮石斛中柚皮素的含量.方法:采用高效液相色谱法测定柚皮素的含量.色谱柱为XB C18(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-0.2％磷酸水溶液为流动相,检测波长为290 nm.结果:柚皮素在0.026～0.208μg线性关系良好(r=1);平均加样同收率为96.3％(RSD 1.8％).同一生长年限不同种植基地铁皮石斛中柚皮素含量波动范围较大;并且同一种植基地铁皮石斛随着生长年限的增加柚皮素的含量先增加后降低,三年生铁皮石斛中柚皮素的含量最高.结论:该方法准确、可靠,可用于铁皮石斛药材及相关产品中柚皮素的含量测定,为完善铁皮石斛药材质量标准提供参考.     

铁皮石斛HPLC特征图谱研究

目的:建立铁皮石斛HPLC特征图谱,为铁皮石斛鉴别提供可靠方法.方法:采用Ultimate XB C18(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-0.2％磷酸溶液为流动相梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,检测波长280nm,柱温30℃.运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会)进行分析.结果:以柚皮素为参照峰,初步构建了由6个特征峰组成的铁皮石斛乙醚部位HPLC特征图谱.结论:该法建立的特征图谱可为铁皮石斛鉴别提供参考.     

一种铁皮石斛立体栽培方法的研究

为了充分利用铁皮石斛设施栽培空间,揭示铁皮石斛立体栽培产量与功效成分的变化规律,提高产品质量、产量与效益。通过田间试验,研究铁皮石斛立体栽培的农艺性状、产量的变化规律;用苯酚-浓硫酸法与2010年版《中国药典》附录ⅩA测定多糖与浸出物含量。结果表明,铁皮石斛立体栽培土地利用率提高2.74倍,茎、叶、总鲜重与干重均高于地栽,多糖含量均值与地栽没有显著差异,但浸出物含量、多糖与浸出物总量明显高于地栽,特别是顶端2层多糖含量、多糖与浸出物总量明显高于其他层次与地栽。立体栽培能有效地提高空间利用率、单位面积产量,多糖与浸出物总量明显高于地栽;立体栽培层间铁皮石斛多糖存在极显著差异,可能与光照因子相关。     

铁皮石斛良种选育进展与对策

品种是中药材规范化栽培的源头,“十五”以来,随着铁皮石斛产业的快速发展,良种需求的增加,铁皮石斛品种选育开展了大量的研究,并取得了显著成效.文章系统地阐述了铁皮石斛种质资源收集与差异性评价、良种选育理论与实践、种苗组织培养与低碳高效生产、DNA分子标记与辅助育种等进展,分析了当前良种选育中存在的主要问题,提出进一步开展良种选育的重点与关键.     

铁皮石斛中基本氨基酸含量变异规律

目的:了解铁皮石斛种质、生理年龄对氨基酸含量的影响,为铁皮石斛药材质量评价与优质药材培育提供依据.方法:采集浙江人工栽培骨干基地一至三年生铁皮石斛11个种质33个样品,经盐酸水解后采用氨基酸分析仪测定基本氨基酸含量.结果:铁皮石斛中7种人体必需氨基酸的平均质量分数为0.28～2.96 mg·g-1,其他9种基本氨基酸的平均质量分数为0.53～4.20mg·g-1;种质对多种氨基酸的积累存在极显著或显著影响,生理年龄对氨基酸的积累也有显著影响,氨基酸含量随着生理年龄增加而增加.结论:铁皮石斛含有丰富的氨基酸,通过品种选育、延长采收期可以增加人体必需氨基酸和其他基本氨基酸的含量.     

铁皮石斛中11种金属元素含量的研究

目的:全面了解不同种质、采收年龄以及市场销售的石斛类药材中11种金属含量与变异规律,为铁皮石斛药材质量评价与优质药材培育提供依据.方法:采集浙江人工栽培骨干基地一至三年生铁皮石斛11个种质32个样品,购买市场销售的石斛类药材11个样品;经湿法消化后采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱法(AAS)测定11种金属元素含量.结果:铁皮石斛中钾、钙、镁、锰、锌、铬、铜平均质量分数分别为1205.23,766.82,158.25,31.06,4.28,8.28,0.97mg·kg(-1),砷、汞、铅、镉4种重金属元素含量除1个样品镉元素超过限量指标0.07 mg·kg(-1)外,均在规定限度范围内;种质与生理年龄对金属元素的积累存在显著的影响.结论:铁皮石斛含有丰富的人体必需金属元素,浙江产的铁皮石斛与市场销售的石斛类药材重金属限量指标整体上是安全的;通过品种选育可望增加人体必需的金属元素含量,降低有害金属元素含量;生理年龄对金属元素的影响与各种元素承担的生理生化作用有关.