一氧化氮合酶与脑缺血早期神经损伤关系研究

目的:探讨大鼠脑缺血早期脑内3种亚型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的表达及作用。方法:采用免疫组织化学方法,用三型NOS的多克隆抗体检测大鼠局灶性脑缺血15、30min及1、2、3、6 h NOS在脑内的表达情况。结果:局灶性脑缺血1 h内缺血侧基底节区内神经元型NOS(nNOS)表达上调;脑缺血1 h内在缺血区小血管壁及3 h时在缺血边缘区小血管壁出现内皮型NOS(eNOS)两次上调。局灶性脑缺血6 h内神经组织中未见诱生型NOS(iNOS)表达。结论:在脑缺血的超早期出现结构型NOS(nNOS及eNOS)的上调表达,此时可能同时存在nNOS的神经损伤作用及eNOS的神经保护作用。     

eNOS解偶联对大脑中动脉栓塞后大鼠神经血管单元的作用及机制

目的探讨大鼠大脑中动脉栓塞模型中,内皮型一氧化氮合酶(e NOS)解偶联对神经血管单元的作用及机制。方法将80只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=40)和大脑中动脉栓塞(MCAO)组(n=40)。参照Longa法制作MCAO模型。栓塞后6 h,通过蛋白印记法检测缺血区e NOS不同偶联状态的表达情况及3-硝基酪氨酸(3-NT)的水平;通过尼氏染色比较缺血区神经元的形态及存活情况;通过免疫组织化学染色比较缺血区星形胶质细胞、微血管内皮细胞以及血脑屏障紧密连接对应的标记物GFAP、VWF、Occludin的表达水平;通过MRI的T2加权序列和动脉自旋标记(ASL)反应栓塞后脑组织病灶范围及血流情况。结果 MCAO后栓塞部位在T2序列上呈高信号,在ASL序列上血流信号减低。e NOS二聚体/单体的比例明显低于假手术组(P0.05);3-NT的含量明显高于假手术组(P0.05)。尼氏染色显示MCAO后神经元大量空泡形成,核固缩变性,数量显著减少;免疫组化结果显示,VWF、Occludin的表达较假手术组明显减少,而GFAP则明显增多(P0.05)。结论 MCAO会导致e NOS解偶联。e NOS解偶联后NO合成受限,而具有毒性作用的3-NT产生增多,炎症反应加重,从而对神经血管单元结构及功能产生破坏作用。     

促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注后claudin-5和TNF-α表达的影响

目的探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对大鼠脑缺血再灌注后紧密连接(tight junctions,TJ)蛋白claudin-5和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的影响。方法采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,伊文思蓝渗透性实验检测血脑屏障(blood brain barrier,BBB)通透性,透射电镜观察脑微血管内皮细胞间TJ的状态,免疫组化法测定claudin-5的蛋白表达,ELISA法检测TNF-α的含量。结果 EPO能够显著降低脑缺血再灌注后BBB的通透性(P<0.01),恢复TJ完整性,显著上调缺血脑组织中claudin-5表达水平(P<0.01),显著降低TNF-α含量。结论 EPO通过降低脑缺血再灌注后脑组织中TNF-α含量,使claudin-5的表达增加,从而恢复TJ完整性,降低BBB通透性。     

实验性血脑屏障细胞模型及其评价

目的 :建立模拟在体血脑屏障 (blood brainbarrier ,BBB)形态、功能的体外细胞模型。方法 :将纯化的 1型星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞分别接种于涂有鼠胶原的Transwell多聚酯膜两侧 ,共培养。分别检测共培养后BBB特异性酶γ 谷氨酰转酞酶 (γ GT)含量 ;测定荧光素钠 (FLU)、12 5Ⅰ 牛血清白蛋白 (BSA)在该模型上的通透量。结果 :共培养后内皮细胞表现出典型细胞形态 ;γ GT含量随共培养酶活性增强 ;模型对大分子蛋白质和小分子物质都具有良好限制通透的作用。结论 :脑微血管内皮细胞与 1型星形胶质细胞共培养能够形成与在体BBB类似的结构 ,并具有在体屏障的限制物质通透、酶屏障的功能     

两种体外血脑屏障细胞模型的比较

目的 :比较两种不同体外血脑屏障 (BBB)模型的功能差异。方法 :采用大鼠脑微血管内皮细胞 (BMEC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别与大鼠脑TIA共同培养于Transwell多聚酯膜的两侧 ,建立两种体外血脑屏障模型。测定两种模型中荧光素钠、牛血清白蛋白的通透量以及屏障特异性酶γ GT的含量。结果 :BEMC构建的BBB模型对低分子量荧光素钠和大分子量蛋白的通透性都小于HUVEC组。在细胞生物化学方面 ,BMEC组γ GT含量为 ( 11 3± 0 66)mgprotein ,而HUVEC组则未测出。结论 :同种属的BMEC与TIA共培养构建的BBB模型是模拟体内BBB的理想选择。     

血脑屏障紧密连接在人脑胶质瘤中的变化

目的 探讨人脑胶质瘤血脑屏障(BBB)内皮细胞间紧密连接的变化及其可能的分子机制. 方法 将南方医科大学珠江医院神经外科自2008年至2009年切除的胶质瘤和正常脑组织标本分为3组:正常脑组织组(n=6)、低级别胶质瘤组(n=11)与高级别胶质瘤组(n=10),采用透射电镜观察标本BBB紧密连接的超微结构特征,应用免疫荧光双标染色和RT-PCR分别检测标本紧密连接蛋白Claudin-5和Claudin-5 mRNA的表达. 结果 电镜结果 显示正常脑组织微血管相邻内皮细胞间可见连续条带状的紧密连接.细胞间未见裂隙.低级别胶质瘤中多数微血管内皮细胞间可见连续的紧密连接,未见明显窗口形成.高级别胶质瘤中微血管内皮细胞间紧密连接破坏严重,内皮细胞间可见明显裂隙;免疫荧光双标染色结果 显示正常脑组织中微血管内皮细胞上有大量Claudin-5表达.低级别胶质瘤中微血管内皮细胞上Claudin-5表达略为下降,而高级别胶质瘤中微血管内皮细胞上无明显Clandin-5表达;RT-PCR结果 显示高级别胶质瘤Claudin-5 mRNA表达低于正常组脑组织和低级别胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 在脑胶质瘤发生发展过程中.胶质瘤细胞可以导致BBB内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5的表达下降及BBB紧密连接结构的破坏,而紧密连接蛋白Claudin-5这一分子元件的表达下降可能是紧密连接结构受到破坏的重要分子机制.     

重症肌无力患者IgG对大鼠脑内NOS不同时间表达的影响

目的观察重症肌无力(myasthenia gravis,MG)患者IgG(AchRab)对大鼠脑内一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,探讨NOS在MG中造成中枢神经系统损害的机制.方法将AchRab IgG或健康人的IgG注入大鼠侧脑室,1次/d,连续4次.免疫组化方法观察不同时间点大鼠脑皮质、海马及杏仁核神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.结果侧脑室注射后1周实验组大鼠皮质、海马神经元nNOS表达量明显减少,后2周实验组皮质、海马神经元nNOS表达下降更为明显,同时杏仁核神经元nNOS表达量也减少;实验组及对照组脑内细胞均未见iNOS表达.结论AchRab侧脑室内注射可引起大鼠皮质、海马及杏仁核神经元nNOS表达量减少,且2周内这种减少效应随时间延长而增强,但未能诱导脑内细胞iNOS表达,提示AchRab尚可通过抑制大鼠中枢神经系统nNOS表达,降低脑内正常的一氧化氮浓度,减弱一氧化氮对脑组织的保护作用,增加神经元的易损性.     

急性局灶性脑挫裂伤后大鼠血脑屏障改变的实验研究

目的:研究急性局灶性脑挫裂伤后大鼠血脑屏障的改变及对脑水肿的影响。方法:采用Feeney's自由落体撞击法建立急性局灶性脑挫裂伤模型。每组6只测量伤侧脑组织伊文思蓝(Evans Blue,EB)含量、脑组织含水量。每组3只电镜观察微血管内皮细胞超微结构改变。结果:急性局灶性脑挫裂伤后24h脑组织含水量为(79.79±0.83)%,与正常对照组(78.68±0.63)%相比有明显差异(P<0.01),脑损伤后6h脑组织中EB含量为(362.12±28.16)ug/g,与正常对照组(11.89±2.28)ug/g相比有明显差异(P<0.01);脑损伤后30min,微血管内皮细胞有轻度受损迹象,伤后3h毛细血管腔内有微绒毛形成,伤后6h微绒毛增多,伤后24~72h毛细血管腔明显狭窄。结论:脑含水量的变化与脑组织中EB含量变化不同步,BBB的开放先于脑水肿的形成。BBB的开放与微血管的机械性损伤、内皮细胞吞饮小泡增加、内皮细胞紧密连接中断有关,也与早期缺血、缺氧关系密切。     

甲基强的松龙对大鼠颅脑损伤后一氧化氮合成酶活性的影响

目的观察甲基强的松龙对大鼠颅脑损伤后血、脑组织中NOS含量的影响,并探讨其作用机制。方法将45只SD大鼠随机分为3组:实验组(20只)、对照组(20只)、正常组(5只),均采用骨窗形成后硬膜外打击法造成鼠脑挫裂伤。正常组麻醉后,只行开颅手术,不作头颅打击,治疗组大鼠致伤后即刻腹腔内注射30mg/kg甲基强的松龙,对照组则注射30mg/kg生理盐水。对照组和治疗组大鼠分别在伤后1h、6h、12h、24h断头取脑,对大鼠脑外伤后脑组织中一氧化碳合成酶(NOS)含量进行检测。结果大鼠脑皮质中的NOS活性在伤后1h较正常组显著性升高(P <0.01),6h开始下降,12～24h降至基础水平。甲基强的松龙治疗组在伤后1h(P <0.01)、6h(P <0.05)NOS活性较损伤组显著性降低。结论颅脑损伤后,受损脑组织中NOS活性升高,甲基强的松龙可通过抑制损伤后NOS活性起到保护创伤神经元的作用。     

脑缺血再灌注损伤后一氧化氮合酶表达变化及知母总皂苷对其影响

目的观察脑缺血再灌注损伤后3型—氧化氮合酶(NOS)在脑内表达的变化,了解知母总皂苷(SAaB)对它们表达的影响。方法大鼠灌胃给药7d,采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,观察大鼠神经功能损害,利用免疫组织化学法观察脑组织中3型NOS表达。结果缺血再灌注组大鼠表现出明显神经功能障碍,神经元型NOS(nNOS)含量明显升高,内皮型NOS (eNOS)仅轻度升高。SAaB低、高剂量治疗组大鼠神经功能障碍较轻,同时脑组织中nNOS表达明显降低,而eNOS的表达增强,经图像分析比较后显示各组表达强度差异具有统计学意义(P＜0．05)。结论各型NOS的表达变化在脑缺血再灌注损伤的机制中起着重要作用,推测SAaB因其减低nNOS表达同时增加eNOS表达的作用,而表现出一定的神经保护作用。     

葛根素对脑缺血再灌注大鼠脑组织eNOS蛋白表达的影响

目的观察葛根素对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用及脑组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响。方法采用神经功能缺损评分评价脑缺血再灌注模型大鼠神经功能变化,取脑测定脑含水量、脑梗死面积和脑组织eNOS蛋白的表达。结果治疗组神经功能缺损较对照组明显减轻,其脑含水量和脑梗死面积减少,脑组织eNOS蛋白表达也减少,但较假手术组高。结论葛根素可通过减少脑缺血再灌注亚急性期脑组织eNOS蛋白的表达而发挥脑保护作用。     

能量限制对大鼠创伤性脑损伤的保护作用

目的能量限制（CR）可产生脑缺血耐受作用,但详细机制尚不清楚。本研究主要探讨CR是否对脑外伤引起的脑损伤起到脑保护作用,及其作用是否与一氧化氮（NO）产生有关。方法SD大鼠分为两组：CR和自由饮食（AL）组,喂养4W后,行大鼠脑损伤模型,进行神经功能评分,并监测造模前后大鼠脑组织及血清中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和NO的含量。结果①CR组脑组织和血清内eNOS表达和NO含量明显高于AL组（P〈0．05）;②神经功能评分显示,CR组大鼠神经功能评分明显好于AL组（P〈0．05）。结论CR可通过上调eNOS表达和促进NO合成对脑外伤引起的脑损伤起到脑保护作用。     

美满霉素改善血管性痴呆大鼠认知功能损伤并抑制氧化应激

目的 观察美满霉素(minocycline)对血管性痴呆大鼠学习记忆功能和脑组织内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响,探讨美满霉素对血管性痴呆的脑保护作用的机制.方法 Wistar大鼠随机分为假手术组(S组)、痴呆模型组(M组)、美满霉素治疗组(MT组).RT-PCR和免疫组织化学法检测大鼠脑组织eNOS、iNOS的表达,行为学检测大鼠学习记忆功能的改变.结果 M组与S组行为学检查显示,M组大鼠有显著学习记忆障碍(P＜0.01),MT组与M组比较行为学检测结果显示,MT组大鼠学习记忆障碍有显著改善(P＜0.01).MT组iNOS表达较M组降低(P＜0.01),MT组eNOS表达较M组增高(P＜0.05);MT组eNOS、iNOS表达较S组增高(P＜0.01);M组eNOS、iNOS表达较S组显著增高(P＜0.01).结论 美满霉素能降低血管性痴呆大鼠脑组织iNOS表达,增强eNOS表达,抑制氧化应激反应,发挥脑保护作用.     

Functional deterioration of endothelial nitric oxide synthase after focal cerebral ischemia

Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) dysfunction is related to secondary injury and lesion expansion after cerebral ischemia. To date, there are few reports about postischemic alterations in the eNOS regulatory system. The purpose of the present study was to clarify eNOS expression, Ser1177 phosphorylation, and monomer formation after cerebral ischemia. Male Wistar rats were subjected to transient focal cerebral ischemia. Endothelial nitric oxide synthase messenger RNA (mRNA) and protein expression increased ∼8-fold in the ischemic lesion. In the middle cerebral artery core, eNOS-Ser1177 phosphorylation increased 6 hours after ischemia; however, there was an approximately 90% decrease in eNOS-Ser1177 phosphorylation observed 24 hours after ischemia that continued until at least 7 days after ischemia. Endothelial nitric oxide synthase monomer formation also increased 24 and 48 hours after ischemia (P<0.05), and protein nitration progressed in parallel with monomerization. To assess the effect of a neuroprotective agent on eNOS dysfunction, we evaluated the effect of fasudil, a Rho-kinase inhibitor, on eNOS phosphorylation and dimerization. Postischemic treatment with fasudil suppressed lesion expansion and dephosphorylation and monomer formation of eNOS. In conclusion, functional deterioration of eNOS progressed after cerebral ischemia. Rho-kinase inhibitors can reduce ischemic lesion expansion as well as eNOS dysfunction in the ischemic brain.     

Thy1.1干细胞对损伤动脉一氧化氮合成酶的影响

背景：目前干细胞移植对血管成形后再狭窄的影响存在争议。 目的：观察大鼠Thy-1.1干细胞局部移植对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响,探讨干细胞移植对内皮型一氧化氮合成酶及诱生型一氧化氮合成酶的影响,并评价干细胞移植对再狭窄的影响与一氧化氮合成酶的关系。 方法：4~6周龄雄性SD大鼠用于制备骨髓Thy-1.1干细胞。雌性SD大鼠随机抽签法法分为3组,干细胞组：于颈总动脉球囊损伤后即刻将约5×106 Thy-1.1干细胞注入至损伤血管局部;损伤组：颈总动脉球囊损伤后局部注入等量生理盐水;对照组：与损伤组共用大鼠,损伤组取材左侧损伤颈总动脉,对照组取右侧未损伤颈总动脉。各组各于术后即刻、3,7,14,21,28 d麻醉并处死大鼠,留取两侧颈总动脉标本。应用组织形态学方法检测内膜增生并进行计算机图像分析,RT-PCR方法检测内皮型一氧化氮合成酶及诱生型一氧化氮合成酶的表达情况。 结果与结论：①干细胞组内膜面积低于损伤组(P < 0.05)。②损伤组内皮型一氧化氮合成酶mRNA明显低于对照组,诱生型一氧化氮合成酶mRNA表达高于对照组(P < 0.05)。③干细胞组内皮型一氧化氮合成酶mRNA及诱生型一氧化氮合成酶mRNA表达均明显高于损伤组(P < 0.05)。提示Thy-1.1干细胞局部移植可抑制内膜增生,对球囊损伤具有修复作用,这可能与Thy-1.1干细胞增加一氧化氮合成酶的表达,促进大鼠颈总动脉球囊损伤后再内皮化有关。     

Local variation in expression of pro- and antithrombotic factors in vascular endothelium of human autopsy brain

The expression of tissue factor (TF), tissue factor pathway inhibitor (TFPI), von Willebrand factor (vWF), endothelial nitric oxide (NO) synthase (eNOS), tissue plasminogen activator (tPA), its inhibitor (PAI-1), and myosin, an indicator of local shear stress, was examined in the endothelium of cerebral vessels according to vessel size and location in human autopsy brains, using immunohistochemistry. Expression of TF, vWF, eNOS, tPA/PAI-1, and myosin was much greater in intracerebral perforating arteries and the microvasculature than the pial and carotid arteries. Expression of all antigens studied was normally faint or negative in the pial and carotid arteries. However, TF, vWF, myosin, tPA, and PAI-1 were strongly expressed in the endothelium of the inner wall of the carotid bifurcation where flowing blood collides, but not in the outer wall. In the endothelium of arteries with fibrillary hyperplasia, vWF, myosin, eNOS, tPA, and PAI-1 were strongly expressed. Within the brain, microvascular expression of TFPI was very faint or negative, whereas that of vWF was intense throughout all brain regions. However, expression of TF and myosin was more intense in the basal gray matter and white matter than in the cortex. eNOS was expressed more strongly in the basal gray matter and cortex than the white matter, whereas tPA and PAI-1 expression was more intense in the white matter than the gray matter. In addition to intrinsic properties of individual vessels, these local variations in expression of pro- and antithrombotic factors in cerebral vessels may in part be due to differences in hemorheological and humoral environments to which they are exposed, and may result in local difference in vulnerability to ischemia. The present findings may in part account for the propensity of thrombus generation in the carotid inner wall, an usual source of artery-to-artery microemboli, frequent development of lacunar (small) infarcts in deep brain regions, and diffuse white matter lesions as seen in Binswanger’s leukoencephalopathy. Received: 5 October 1998 / Revised: 4 January 1999 / Accepted: 5 January 1999     

Troxerutin cerebroprotein hydrolysate injection ameliorates neurovascular injury induced by traumatic brain injury – via endothelial nitric oxide synthase pathway regulation

Abstract

Background: Neurovascular dysfunction caused by traumatic brain injury (TBI) is characterized by cerebralvascular damage, blood–brain barrier (BBB) breakdown, brain edema, etc. This study was designed to assess the protective role of 5 days troxerutin cerebroprotein hydrolysate (TCH) injection treatment against TBI, as well as the potential mechanism.

Methods: The weight-drop model of TBI in male Sprague-Dawley rats was chosen to induce TBI model, rats either with TCH or a vehicle via intraperitoneal injection were examined 3 days after TBI.

Results: TCH resulted in alleviation of neurological deficits, reduction of infarct volume, improvement of regional cerebral blood flow (rCBF), amelioration of neuronal death, astrocyte proliferation, endothelial cell loss, and BBB dysintegrity. These effects of TCH treatment against TBI were through endothelial nitric oxide synthase (eNOS) coupling/decoupling status adjustment, which not only increased nitric oxide (NO) level, but also decreased peroxynitrate level expression.

Conclusions: All the results indicated that TCH injection has multifaceted protective effects of neurovascular unit (NVU) against TBI via eNOS pathway regulation.     

Expression of nitric oxide synthase in the cerebral microvasculature after traumatic brain injury in the rat

Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase (NADPHd) histochemistry and nitric oxide synthase (NOS) immunocytochemistry were performed on sections of brain after moderate traumatic brain injury. There was a pronounced increase in NADPHd reactivity and an induction of the endothelial NOS (eNOS) isoform in microvessels surrounding the cortical contusion by 24 h post-injury. This altered microvascular state may contribute to barrier breakdown and hyperemia which characterize traumatic brain injury.     

依达拉奉预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤后皮质一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨依达拉奉预处理对小鼠脑缺血再灌注(IR)损伤后皮质一氧化氮合酶(NOS)表达的影响。方法 48只健康ICR小鼠被分为假手术组、对照组和依达拉奉组。依达拉奉组和对照组分别给予依达拉奉3 mg/(kg.d)和同等体积的生理盐水腹腔注射共7 d,然后建立小鼠IR模型;缺血1 h、再灌注24 h时应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测量各组脑梗死体积,应用免疫组化法检测各组小鼠皮质神经元型、、诱导型和内皮型NOS(nNOS、iNOS、eNOS)阳性细胞数。结果与假手术组比较,对照组小鼠皮质nNOS、iNOS和eNOS阳性细胞数明显增多(均P<0.05);与对照组比较,依达拉奉组脑梗死体积明显缩小,皮质nNOS和iNOS阳性细胞数明显减少,eNOS阳性细胞数明显增多(均P<0.05)。结论依达拉奉预处理可以影响IR小鼠皮质nNOS、iNOS和eNOS的表达,发挥神经保护作用。     

通心络胶囊对血管性痴呆小鼠脑血管储备能力的影响

目的 观察通心络胶囊对血管性痴呆（VD）小鼠脑血管储备功能的影响。方法 用夹闭双侧颈总动脉，同时腹腔注射硝普钠制做VD小鼠模型。通心络灌胃（0.2 g·kg-1·d-1）处理小鼠，生理盐水作为对照。18只小鼠随机分为假手术组（对照组）、模型加生理盐水组（安慰剂组）、模型加通心络组（治疗组）。处理30 d后应用RT-PCR和免疫印迹方法测定小鼠海马部位血管内皮细胞生长因子（VEGF）和一氧化氮合酶（eNOS）的表达。结果 （1）RT-PCR：对照组与安慰剂组的eNOS基因mRNA表达无明显差异，而治疗组eNOS mRNA表达明显增强，与安慰剂组比较差异有统计学意义（P <0.01）。治疗组VEGF mRNA表达明显高于安慰剂组，差异有统计学意义（P <0.01）；（2）Western Blot：安慰剂组的eNOS和VEGF蛋白表达高于对照组（P <0.05），治疗组eNOS和VEGF蛋白表达明显上调，高于安慰剂组，差异有统计学意义（P <0.01）。结论 通心络能明显增强VD模型大鼠海马组织VEGF和eNOS表达，提高其脑血管储备能力,从而减轻VD模型小鼠的缺血性脑损伤。