MDR1/MRP反义寡核苷酸逆转胃癌细胞耐药的研究

目的:探讨MDR1/MRP反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodooxynucleotide,ASODN)片段逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药(Multidrugresistance,MDR)的作用.方法:经MDR1或多药耐药相关蛋白(Multidrugresistance-asscociated protein,MRP)ASODN分别或联合转染SGC7901/ADM细胞后,采用RT-PCR法检测MDR1mRNA和MRPmRNA的表达.免疫细胞化学检测SGC7901/ADM细胞内p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、MRP的表达,流式细胞术检测瘤细胞内Rh123的潴留状况,MTT法检测瘤细胞对阿霉素、卡铂等抗癌药的敏感性.结果:SGC7901/ADM细胞经ASODN转染12h后,MDR1和MRP mRNA的表达均降低,转染24h后下降最明显,48h后恢复至转染前水平.经转染ASODN48h后,SGC7901/ADM细胞P-gp、MRP的表达显著下降,瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于转染前,且联合转染MDR1和MRP ASODN后瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于单纯转染组.SGC7901/ADM细胞在联合转染MDR1和MRP ASODN后对阿霉素、卡铂等化疗药物的敏感性明显高于单纯转染ASODN.结论:分别转染MDR1或MRP ASODN可部分逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药,而联合转染2种ASODN则可显著提高瘤细胞耐药逆转效率.     

奥曲肽逆转肝癌细胞多药耐药机制的初步研究

目的：探讨生长抑素类似物奥曲肽(octreotide)逆转肝癌细胞多药耐药，增加肝癌细胞对化疗药物敏感性的机制。方法：应用MTT法分析肝癌细胞对化疗药物的敏感性；用RT—PCR、流式细胞术检测肝癌细胞多药耐药基因MDR1、MRP2 mRNA蛋白质的表达。结果：奥曲肽联合化疗药物可以显著降低各化疗药物的IC50。肝癌原代培养细胞有SSTR2、SSTR3、MDR1、MRP2的表达，奥曲肽可以显著降低肝癌细胞表面MDR1、MRP2的表达。结论：奥曲肽可以与肝癌细胞表面的SSTR结合，降低肝癌细胞表面MDR1、MRP2的表达，从而使细胞内细胞毒药物浓度增加，逆转肝癌细胞多药耐药。     

赤芍总苷抑制人黑色素瘤A375细胞株增殖作用的研究

目的观察赤芍总苷(TPG)对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响及其作用机制。方法黑色素瘤A375细胞,分别加入12.5、25、50、100、200 mg/L TPG,对照组加等量0.9%氯化钠注射液,孵育48 h。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞生长抑制率,用RT-PCR、Western blot法分别检测增殖细胞核抗原(PCNA)、P21、P27、P53 mRNA及其蛋白的表达水平。结果不同浓度(12.5、25、50、100、200 mg/L)TPG刺激后,对黑色素瘤细胞均具有明显的增殖抑制作用。100 mg/L TPG作用黑色素瘤细胞48 h,PCNA mRNA及其蛋白表达水平较对照组显著下降,而P21、P27、P53的mRNA及其蛋白表达水平较对照组显著上升,差异有统计学意义(P<0.01)。结论TPG抑制黑色素瘤A375细胞增殖,与下调PCNA表达及上调P21、P27、P53表达有关。     

赤芍总苷对人黑色素瘤A375细胞迁移及侵袭活性的影响

目的观察赤芍总苷(total paeonyglucosides,TPG)对人黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭能力的影响,探讨TPG抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭的相关机制。方法体外培养黑色素瘤细胞,分别加入5、15、20、25 mg/LTPG,细胞划痕实验测定迁移力;Transwell小室侵袭实验测定侵袭活性。RT-PCR和Western bolt方法检测黑色素瘤细胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2 mRNA和蛋白的表达。结果 TPG能显著抑制黑色素瘤A375细胞的迁移和侵袭,与对照组比较,TPG组细胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达明显下降,TIMP-2 mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.01)。结论 TPG可通过下调MMP-2、MMP-9,上调TIMP-2,调节MMP-TIMP平衡,发挥抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭的作用。     

NHE-1特异性抑制剂DMA逆转HL-60/ADM细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨钠/氢交换器-1(Na /H exchanger-1, NHE-1)特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪(dimethyl amiloride, DMA)是否能在体外逆转耐药细胞株HL-60/ADM的多药耐药及其可能机制.方法 以阿霉素诱导产生多药耐药(multidrug resistance, MDR)的HL-60/ADM细胞株为研究对象,用MTT法检测化疗药物敏感性,流式细胞仪检测细胞内柔红霉素积累量,RT-PCR法检测mrp、bcl-2、bax mRNA表达,免疫细胞化学法检测细胞膜多药耐药相关蛋白(MRP)表达,TUNEL法检测原位细胞凋亡.结果 与50 μmol/L DMA共同培养24 h后,HL-60/ADM细胞对ADM、MIT、VCR、HAR 4种化疗药物的IC50值分别由(839.5±45.2 )、(321.2±28.9)、(70.5±15.5)、(65.2±20.7)ng/ml降低至(180.5±38.9)、(76.4±12.0)、(30.2±7.5)、(31.7±7.2)ng/ml;分别与50、100 μmol/L DMA共培养24 h后,HL-60/ADM细胞内DNR积累量荧光强度由作用前的33.56升高到48.74和70.10,细胞内mrp mRNA表达量、MRP蛋白表达量及bcl-2 mRNA表达量明显降低,bax mRNA表达量明显升高;与100 μmol/L DMA共同培养24 h后,5 μg/ml ADM作用下的HL-60/ADM细胞凋亡率明显增高.结论 DMA可逆转HL-60/ADM细胞的MDR,其机制可能与下调MRP表达及促进bcl-2/bax凋亡途径有关.     

赤芍总苷对人黑色素瘤细胞A375血管生成因子VEGF和Ang-2的影响

目的探讨赤芍总苷(TPG)对人黑色素瘤A375细胞血管内皮生长因子(VEGF)和促血管生成素-2(Ang-2)表达的影响。方法体外培养人黑色素瘤A375细胞,分别加入12.5、25、50、100、200mg/LTPG,对照组加入等量生理盐水,孵育24h、48h后,MTT方法测定生长抑制率;RT-PCR、Western blot分别测定TPG处理48h后VEGF和Ang-2 mRNA和蛋白的表达。结果 MTT结果显示TPG对黑色素瘤细胞增殖有显著抑制作用;RT-PCR、Western blot结果显示,TPG可显著抑制人黑色素瘤细胞VEGF、Ang-2 mRNA水平及蛋白水平的表达。结论 TPG具有显著的抗黑色素瘤瘤血管生成的作用,其机制可能与下调VEGF、Ang-2的表达有关。     

脊索瘤细胞系CM-319中放化疗抵抗相关基因的表达及临床意义

[目的]探讨多药耐药相关基因如缺氧诱导因子1d（HIF-1α）、多药耐药基因（MDR1）及多药耐药相关蛋白（MRP1）在脊索瘤细胞系CM－319中的表达及临床意义。[方法]用RT—PCR检测HIF－1α、MDR1、MRP1基因表达,间接免疫荧光及免疫细胞化学Envision法检测HIF－1α、MRPl蛋白在CM－319中的表达情况,并分析其与放化疗抵抗的关系。[结果]常氧条件下,在脊索瘤细胞系中能检测到HIF～1α及MRP1 mRNA的表达,但未检测到MDR1 mRNA的表达（P〈0．01）,间接免疫荧光及免疫细胞化学可以检测到HIF-1α表达在细胞浆及核中,而MRP1主要表达在细胞浆中。[结论]HIF-1α与MRP1的过度表达在脊索瘤的放化疗抵抗中可能具有重要作用,而MDR1表达未被检测到,提示脊索瘤的放化疗抵抗主要与HIF－1α和MRP1相关。     

薏苡仁注射液对肺腺癌细胞多药耐药性逆转作用的机制研究

目的 观察薏苡仁注射液(康莱特)对人肺腺癌细胞A549多药耐药性(MDR)逆转作用,并对其机制进行探讨.方法 体外培养人肺腺癌细胞系A549并以不同剂量康莱特进行处理,磺酰罗丹明(sulphorhodamine B,SRB)染色法检测药物对各组细胞的抑制率;反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测多药耐药因子多药耐药基因1(MDR1)、生存素(Survivin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax) mRNA在各组中表达情况;蛋白质印迹(Western blot)法检测P-糖蛋白(P-gp)、Survivin、Bcl-2、Bax蛋白水平表达,将各组结果进行比较.结果 4组肺腺癌细胞A549的抑制率比较,差异有统计学意义(P<0.05).其中,与空白对照组比较,康莱特低、中、高剂组抑制率降低,差异均有统计学意义(P<0.05).康莱特中、高剂组抑制率比较,差异亦有统计学意义(P<0.05).康莱特低、中、高剂组MDR1、P-gp、Survivin、Bcl-2表达降低,Bax表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 康莱特可抑制肺腺癌细胞生长,该药具有明显的逆转肺腺癌多药耐药性的作用,该作用是通过调节多药耐药因子的表达而实现的.     

两种人骨肉瘤 U2OS 细胞阿霉素耐药株的比较

目的研究不同方式建立的人骨肉瘤 U2OS 细胞阿霉素耐药株的生物学特性及其耐药机制.方法采用大剂量间隙作用、浓度梯度递增间隙作用建立 U2OS 阿霉素耐药株 U2OS/ADM1,U2OS/ADM2,光镜及透射电镜下观察细胞形态变化;MTT 法测定其耐药指数、药物敏感性,绘制生长曲线计算倍增时间;罗丹明外排实验检测 P-糖蛋白(P-gp)泵功能;RT-PCR 检测多药耐药基因1(MDR1)mRNA、多药耐药相关蛋白1(MRP1)mR-NA 的表达.结果 U2OS/ADM1,U2OS/ADM2的耐药指数分别为79.63和91.06,对紫杉醇、顺铂有交叉耐药;细胞倍增时间延长(P <0.01);耐药株细胞线粒体丰富,粗面内质网及游离核糖体增多;细胞内罗丹明蓄积量低于亲本细胞(P <0.01),两种耐药株之间无明显差异(P >0.05);MDR1mRNA,MRP1mRNA 表达均高于亲本细胞(P <0.05),MDR1mRNA 表达两种耐药株间无明显差异(P >0.05),U2OS/ADM1的 MRP1mRNA 表达低于U2OS /ADM2(P <0.05).结论两种耐药株均可产生 MDR,耐药机制可能与 MDR1,MRP1过表达有关;不同建立方式存在一定差异,浓度梯度递增间隙作用方式更容易产生耐药.     

靶向MDR1基因siRNA逆转HepG2/ADM细胞耐药性的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人类肝癌细胞系/阿霉素(human hepatocellular liver carcinoma cell line/adriamycin,HepG2/ADM)细胞中多耐药基因,探讨该基因能否有效地抑制多耐药基因(multidrug resistance gene,MDR1)及其编码的糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,并检测对HepG2/ADM耐药表型的逆转效果.方法 采用药物大剂量冲击法建立HepG2/ADM耐药模型,构建靶向MDR1的小干扰RNA表达载体,并转染到HepG2/ADM细胞中,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测基因转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,Western-blot检测各组细胞P-gp蛋白表达的变化,用噻唑蓝法检测各组细胞对阿霉素、顺铂、长春新碱和氟尿嘧啶等药物的敏感性.结果 HepG2/ADM细胞系不仅对阿霉素耐药,而且对其他化疗药也有抗性,呈现多药耐药特性;重组质粒鉴定结果表明针对MDR1的小干扰RNA表达载体成功构建;与对照组比较,转入细胞后MDR1 mRNA水平明显下降,P-gp蛋白表达明显降低;转入细胞后HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性明显提高,部分逆转其耐药性.结论 靶向MDR1的小干扰RNA可显著抑制HepG2/ADM细胞中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,逆转P-gp介导的HepG2/ADM细胞的耐药性.     

赤芍总苷联合卡铂对黑色素瘤细胞生长的抑制及相关机制研究

目的研究赤芍总苷(total paeonyglucosides,TPG)联合化疗药物卡铂(CBP)对人黑色素瘤A375细胞生长的抑制作用及相关机制。方法用TPG和CBP作用于体外培养的黑色素瘤细胞,SRB法检测药物对黑色素瘤细胞生长的作用,逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测各组细胞PCNA、cyclin D、P21 mRNA的表达情况;Western blot法检测各组细胞PCNA、cyclin D、P21蛋白表达水平。结果 CBP处理组OD值较对照组明显降低,TPG联合CBP导致OD值进一步下降(P<0.01);CBP处理组黑色素瘤细胞PCNA和cyclin D mRNA和蛋白水平均较对照组显著降低(P<0.01),而P21 mRNA和蛋白水平则明显升高(P<0.01);TPG联合CBP作用于黑色素瘤细胞,PCNA和cyclin D mRNA和蛋白水平较CBP单独作用组下降更为明显;P21 mRNA和蛋白水平较CBP单独作用组升高更加显著。结论 TPG和CBP联合用药效果优于CBP单独用药,可进一步提高药物对肿瘤细胞的生长抑制,与降低PCNA和cyclin D表达、升高P21表达有关。     

人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的建立及耐药相关基因表达检测

目的：建立人肝癌多药耐药细胞系,研究其耐药特性及机制。 方法：应用人肝癌细胞株BEL-7402,采用阿霉素（ADM）大剂量间歇诱导法,建立多药耐药细胞系BEL-7402/ADM。相差显微镜观察细胞,用MTT法检测该耐药细胞株对多种化疗药物的多药耐药性,采用流式细胞术检测该耐药细胞表面多药耐药基因(MDR)的表达产物P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)及谷胱甘肽硫转移系统(GSH／GST)的表达情况,应用RT-PCR检测MDR、MRP基因表达水平。 结果：BEL-7402/ADM对多种抗癌药物产生耐药,对ADM的耐药性(半数抑制浓度,IC₅₀)提高了17.31倍。流式细胞仪分析发现（65.5±5.8）%的BEL-7402/ADM细胞表面P-gp 表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（31.3±4.3）%;（32.4±3.5）%的BEL-7402/ADM细胞表面MRP表达阳性,而对照细胞BEL-7402表达仅为（23.4±3.1）%,二者差异有显著性(P<0.01);BEL-7402/ADM和BEL-7402细胞的GSH／GST表达无明显变化（P>0.05）。RT-PCR检测发现BEL-7402/ADM中MDR及MRP mRNA高表达。 结论：BEL-7402/ADM具有明确的多药耐药性,其多药耐药相关基因MDR及MRP mRNA表达升高。     

缺氧诱导鼻咽癌细胞株CNE2化疗耐药及其机制

目的：探讨缺氧环境下人鼻咽癌多药耐药相关基因和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达和意义,从而部分阐明鼻咽癌发生多药耐药的机制,为逆转鼻咽癌耐药提供新的分子靶点.方法：将人鼻咽癌细胞系CNE2分别行不同时间低氧培养,MTT法检测CNE2对紫杉醇、顺铂及5-氟尿嘧啶的耐药倍数;流式细胞仪检测缺氧与常氧下细胞的凋亡情况.应用RT-PCR和Western Blot分别检测每组CNE2细胞中多药耐药相关基因（mdr1）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）和HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表达.结果：缺氧培养48 h,CNE2对紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药倍数较常氧分别提高2.14,1.86,1.43倍,且药物引起的凋亡减少.在缺氧组,随着缺氧时间的延长,CNE2细胞中多药耐药相关基因mdr1,MRP1的表达均逐渐增高,而且这些多药耐药相关基因的表达与HIF-1α的表达呈同步化改变.结论：缺氧可上调鼻咽癌细胞内的核转录因子HIF-1α以及多药耐药相关基因的表达,从而诱导鼻咽癌产生多药耐药性.核转录因子HIF-1α和这些多药耐药相关基因可能成为逆转鼻咽癌耐药的新的分子靶点.     

MDR、MRP与肝癌细胞多重耐药性关系的研究

目的 探讨肝癌细胞多重耐药性形成的分子机制。方法 采用逐步培养法，诱导人肝癌细胞株HepG2产生耐药性，以MTT法测定其耐药性的程度，检测细胞表面MDR、MRP分子表达水平，并确定其与耐药性的关系。结果 耐药细胞表面MDR、MRP的表达明显增高，药物在细胞内的积聚减少；阻断MDR、MRP的功能，可明显逆转细胞的耐药性。结论 MDR、MRP的高表达是肝癌细胞形成多重耐药的性要机制之一。     

重组腺病毒介导MRP反义RNA逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721／ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒（Ad—Asmrp）,在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素（ADM）及柔红霉素（DNR）的半数致死量（IC50）并计算耐药倍数（RF值）;在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P。。表达、并用RT—PCR反映细胞MRP之mRNA水平的变化。结果携带MRP反义RNA的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0．487μg／ml、0．328μg／ml,RF值分别为97．4、109．3,RF值分别下降36．8和35．4。在转染后24h,MRPmRNA水平开始下降并呈持续下降趋势（P〈0．01）,48h后伴有P190蛋白表达的持续下降（P〈0．01）,二者趋势一致。转染后48h,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度明显上升（P〈0．01）。结论重组腺病毒介导的MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。     

携反义mrp和mdr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(m rp)和反义多药耐药基因(m dr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(M DR)的研究。方法将m rp基因cDNA 5′端500 bp的基因片段与m dr1基因cDNA 5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(m rp m dr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV H e lper-F ree System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS与AAV H e lper-F ree System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pH e lper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS。结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS,病毒滴度达2.5×108efu/m l。结论构建的rAAV 2-(m rp m dr1)AS可望能将反义m rp和m dr1基因片段导入HCC耐药细胞株。     

和厚朴酚对U937/ADR细胞系耐药逆转作用及其机制研究

目的 探讨和厚朴酚（HNK）对白血病细胞U937阿霉素（ADR）耐药细胞系U937/ADR多药耐药逆转作用及其机制。方法 以大剂量（IC₅₀）ADR短时间诱导方法,构建U937/ADR细胞系。以低浓度HNK（IC₂₀）与不同化疗药物联合作用于U937/ADR细胞系,检测其对不同化疗药物耐药逆转倍数。罗丹明123检测药物外排功能;荧光定量PCR（FQ-PCR）和Western blotting检测不同浓度HNK对U937/ADR细胞系核转录因子-κB(NF-κB)和耐药相关基因MDR1及其蛋白P-糖蛋白（P-gp）表达的影响;ELISA法检测NF-κB亚单位p65（NF-κB p65）的DNA结合活性。结果 成功构建了白血病多药耐药细胞系U937/ADR,对ADR耐药指数为亲代U937细胞的11倍。6.5 μg/mL HNK可以逆转U937/ADR对ADR的耐药,逆转倍数为2.20倍。HNK能够浓度依赖性地下调U937/ADR细胞NF-κB、MDR1 mRNA和P-gp表达,抑制NF-κB p65的活性。结论 HNK能有效逆转U937/ADR多药耐药,其机制可能与抑制NF-κB p65活性、下调MDR1和P-gp表达有关。