下一代测序技术在分子诊断中的应用

DNA测序是破译人类疾病的一种强大技术,尤其在癌症方面。飞速发展的下一代测序(next-generation sequencing,NGS)极大降低了测序成本,并且实现了高通量,这使我们可以获得整个基因组的序列,以及那些临床上确诊病人的全部基因组信息。然而下一代测序技术带来诸多益处的同时也带来了挑战,那就是怎样使这个技术在临床诊断中成为常规手段。本文就目前NGS的几大技术平台原理,在临床诊断中的应用,以及目前面临的挑战等进行综述。     

高通量测序技术在五类疾病分子诊断中的应用及质量管理策略

高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称下一代测序(next generation sequencing, NGS)能一次并行对成千上万个基因进行测序,极大地提高了DNA测序效率并降低了成本。近年来,NGS在医学研究和临床诊断中的应用日益广泛,在无创产前筛查,肿瘤筛查、诊断和治疗,微生物病原体检测,遗传性疾病的筛查与诊断及器官移植排斥筛查等多个领域具有广泛的应用前景。NGS技术作为一项新兴技术,在相关临床应用中也存在诸多问题,其质量管理体系尚不完善,还面临许多挑战,需要医学实验室和相关部门共同努力,以促进NGS在临床诊断中规范开展。     

下一代测序技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用

以下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)为代表的基因组学技术的迅猛发展给全面深度的染色体筛查和基因诊断提供了机会。NGS也迅速应用于胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)和胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)临床检测中,成为常规检测技术,经济与可靠使其具有更广阔的应用前景。单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术的进步使得NGS在PGD和PGS的临床应用中能够更加全面了解植入前胚胎的遗传学信息,可以检测到更加细微的差异;基于NGS技术的PGS和PGD将给移植成功率和试管婴儿(in-vitro fertilization,IVF)出生率带来明显提升。本文主要介绍PGD/PGS的定义、传统的PGD/PGS检测技术,单细胞全基因组扩增技术以及NGS在PGD/PGS中的应用。     

单细胞测序技术及其在肿瘤研究和临床诊断中的应用

肿瘤组织的异质性是肿瘤的一个重要特征。肿瘤细胞均一性的缺乏使得肿瘤靶向治疗的难度加大。因此,鉴别肿瘤细胞的异质性是一个重要工作。单细胞测序技术(single-cell sequencing,SCS)是通过下一代测序手段观察单个细胞的基因组序列信息,从而获得细胞间遗传物质和蛋白质信息的差异,因此能够更好地理解单个细胞在其微环境中的功能。通过对单个肿瘤细胞全基因组、转录组以及细胞表观遗传基因进行测序,瘤内异质性的复杂机制可被揭示,从而改善肿瘤诊断、转归预测和治疗效果的监测。本文对单细胞测序技术的发展、检测原理和检测流程、存在的问题及其在肿瘤研究中的应用以及该技术在临床上的潜在价值进行了概述。     

肺癌患者EGFR及KRAS基因突变检测方法的建立和临床应用

目的本研究拟在评估二代测序(next generation sequencing,NGS)技术在肺癌临床分子诊断中应用的可行性。方法本研究选取108例肺癌石蜡包埋样本(formalin fixed paraffin embedded,FFPE),同时进行一代测序(sanger sequencing)和NGS检测样本中EGFR和KRAS基因的突变情况。结果在108例肺癌样本中,一代测序检出突变在二代测序中均检出,另外NGS还检测出目标区域外其他突变。结论 NGS的检测准确性可达到100%。NGS可以应用于肺癌临床分子诊断,同时NGS能给临床提供更详细的基因突变信息,为分子靶向治疗提供依据,更具有市场潜力及应用前景。     

第二代测序技术与无创产前诊断

孕妇外周血中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的发现开辟了无创产前诊断的新篇章,借助各种分子诊断技术针对cffDNA进行胎儿染色体疾病、遗传性疾病以妊娠相关疾病的研究迅速成为热点。以高通量、自动化为显著特征的第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术诞生,极大加速了cffDNA的实验室研究进展。目前基于NGS平台,建立的胎儿21/18/13三体综合征的产前基因诊断技术已应用于临床,其他如性染色体非整倍体、双胎妊娠染色体非整倍体、胎儿染色体结构异常疾病以及孟德尔单基因遗传病的研究也因NGS的出现获得了显著的进步。本文就NGS的基本原理、cffDNA的生理特性及NGS在无创产前诊断研究中的进展进行综述。     

肺泡灌洗液二代基因测序在鹦鹉热衣原体感染肺炎诊断中的应用

目的 探究肺泡灌洗液二代基因测序(NGS)技术在鹦鹉热衣原体感染肺炎诊断中的应用价值。方法 选择2019年3月-2021年4月东莞市人民医院收治的13例鹦鹉热衣原体感染肺炎患者,收集其肺泡灌洗液进行传统病原检测和二代基因测序技术病原检测,同时采集患者的痰样本进行二代基因测序技术检测,分析不同检测方法对鹦鹉热衣原体感染肺炎的诊断效能。结果 肺泡灌洗液NGS对鹦鹉热衣原体的阳性检出率显著高于传统病原检测和痰样本NGS(P<0.05)。肺泡灌洗液NGS、痰样本NGS的检测结果回报耗时显著短于传统病原测定(P<0.05)。结论 肺泡灌洗液NGS技术能够显著提高鹦鹉热衣原体感染肺炎的诊断准确率,且检测结果回报快,可为临床制定合理的抗感染治疗方案提供精准的依据,进而有效改善患者的临床结局,减少其治疗费用。     

高通量测序技术在新生儿疾病筛查中的应用进展

新生儿疾病筛查(NBS)是世界范围内降低新生儿致残率和死亡率的重要措施。随着基因组学和分子技术的发展,高通量测序成为近几年迅速发展的DNA测序技术,其通过一次性检测可以发现上百种遗传病,并可对疾病进行准确诊断及分型,其为NBS提供了新途径。该文对近年关于高通量测序技术(NGS)在NBS中的应用进行综述。     

下一代测序技术在遗传相关性智力障碍诊断中的应用

智力障碍(intellectual disability,ID),是一种严重危害儿童身心健康的综合症,不但影响患者自身的生活质量,也给其家庭和社会带来沉重负担。ID病因十分复杂,既有外在的环境因素又有内在的遗传因素。近年来,下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)从一种新兴技术变成了主流检测技术被逐渐应用于临床诊断,其通量高、快速、高效等优势为遗传性疾病的诊断研究带来重大变革。本文将从智力障碍概述、病因分析、遗传性检测技术以及NGS在遗传性智力障碍诊断中的应用4个方面进行综述,以期为相关性智力障碍病人的临床诊断方法的选择提供帮助。     

串联质谱与高通量测序技术在新生儿疾病筛查中的应用

目的 探讨串联质谱（tandem mass spectrometry,TMS）联合高通量测序技术（又称新一代测序技术,next generation sequencing,NGS）在新生儿疾病筛查中的应用价值。方法 依托妇幼健康服务联合体,对2015年4月至2018年5月期间常州地区出生的50844例新生儿开展TMS初筛,对初筛阳性病例运用NGS等技术进行鉴别诊断和基因诊断。结果 50844例新生儿经TMS初筛阳性650例,召回再次TMS检测结果阳性54例,对该54例病例运用NGS技术进行检测,最终确诊19例为遗传代谢病患儿,总体发病率为1/2676。结论 TMS联合NGS开展新生儿疾病筛查,能更早、更多地发现新生儿遗传性代谢疾病,从而达到早干预、早治疗的目的。     

靶向捕获高通量测序技术在遗传性疾病分子诊疗中的应用

目的应用靶向捕获高通量测序技术对常见遗传性疾病进行基因突变分析,为患者及家庭提供基因诊断的依据。方法对1例神经纤维瘤家系和1个脊椎骨骺发育不良的家系应用高通量测序技术进行相关基因检测。结果在神经纤维瘤患者中检测到符合临床提示的致病性基因突变,NF1基因第16内含子c. 1845+1_1845+5delGTAAG,脊椎骨骺发育不良的家系中检测到TRAPPC2基因第5外显子c. 271_275delCAAGA半合子致病突变。Sanger测序的验证结果与高通量测序一致。结论靶向捕获高通量测序技术可以在基因组水平对一些遗传性疾病进行分子诊断,评估预后,并为患者及亲属提供遗传咨询,预测再发风险以及提供产前诊断。     

高通量测序技术在检测循环肿瘤细胞中的应用

肿瘤作为一种基因组疾病,常涉及一系列基因组变化。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是原发肿瘤和转移瘤的桥梁,往往可揭示原发肿瘤和转移瘤的遗传特性。目前CTCs的检测方法有很多,但鉴于CTCs在循环外周血中的量非常稀少,纯度低,常规方法的检测不能提供肿瘤形成、分化、转移的本质。基于大规模平行测序的高通量测序技术可从分子层面对CTCs进行基因序列分析,对肿瘤诊断、预后判断、转移、个体化治疗提供更多的信息。循环肿瘤细胞结合高通量测序技术在未来研究中展现出广阔的前景,本文就循环肿瘤细胞的检测方法,高通量测序技术的应用成果及进展作一综述。     

病原真菌基因组流行病学研究进展

基因组流行病学研究为病原真菌的遗传进化、传播和表型研究提供了新的视角, 其核心技术是全基因组测序技术和生物信息学分析, 极大地弥补了传统分子分型技术的不足。通过将病原真菌的全部遗传信息和流行病学调查相结合, 能够预测病原真菌的传播途径和传播风险, 为制定真菌防控的公共卫生策略提供理论基础。本文将对分子流行病学、基因组流行病学的发展以及基因组流行病学在病原真菌的遗传关系、溯源及进化、耐药性以及毒力、全基因组关联分析等方面的应用进行综述, 并对病原真菌基因组流行病学未来发展做出展望。     

基于Ion Torrent S5平台的二代测序技术对HLA-DRB1基因分型模棱两可进行分析

目的基于Ion Torrent S5平台NGS法进行HLA-DRB1基因分型检测的模棱两可结果的种类、比例进行分析。方法对471例脐带血造血干细胞库标本采用基于Ion Torrent S5平台的二代测序法检测HLA-DRB1位点,并同步对其中的94例标本采用PCR-SBT测定HLA-DRB1位点,余下377例标本采用PCR-SSO流式磁珠法检测。使用分型软件指定NGS法的HLA-DRB1分型结果,以HLA-DRB1*后第三区的数字作为高分辨水平统计,直接计算法分析模棱两可组合比例。结果标本中470例HLA-DRB1基因NGS检测结果与PCR-SBT法或PCR-SSO法相符合;其中1例标本NGS法漏检一个等位基因,符合率为99.8%。NGS法检测结果中,471例标本中有160例标本HLA-DRB1等位基因型出现模棱两可,比例为33.97%(160/471)。最常见的模棱两可结果组合为DRB1*09∶01∶02/09∶21。结论基于Ion Torrent S5平台的NGS技术可降低HLA-DRB1基因分型的模棱两可结果比例,但仍有一定比例的模棱两可组合结果,同时应注意NGS法检测漏检等位基因的风险。     

长读长测序技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用

近年来, 长读长测序技术发展迅速, 在基因组、转录组、表观遗传学等研究方向发挥了重要作用, 并显示出在临床检测领域的广阔应用前景。本文介绍了主要的长读长测序平台的基本原理和性能, 综述了该技术在胚胎植入前遗传学检测中的研究进展, 以及当前面临的主要挑战和未来可能的发展方向。     

高通量测序技术在病原生物学方面的研究进展

高通量测序技术(high-throughput sequencing),又称为下一代测序技术(next-generation se-quencing,NGS),具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势。随着高通量测序技术的迅猛发展,科研工作者开始越来越多地应用高通量测序技术来解决各种生物学问题。本文即对高通量测序技术在病原生物学的应用以及研究进展方面作以综述。     

高通量测序与荧光原位杂交检测早期自然流产绒毛染色体异常的分析

目的探讨荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)、高通量测序(next generation sequencing,NGS)两种技术方法在自然流产绒毛染色体异常检测中的应用价值。方法回顾性分析石家庄市第一医院2017~2019年间早期自然流产患者112例,对其绒毛样本进行FISH和NGS分析,并利用统计学方法分析两种方法检测流产胚胎染色体异常的差异。结果FISH检测样本的成功率100.00%(112/112),其中检测异常54份,占比48.21%(54/112);NGS检测样本的成功率100.00%(112/112),其中检测异常58份,占比51.79%(58/112)。两种方法同时检测出绒毛染色体异常52例,同时检测出绒毛染色体无异常52例,FISH检测绒毛染色体正常而NGS发现有异常的6例,NGS检测绒毛染色体正常而FISH检测异常的2例。两种方法检验效果相同(Kappa=0.857,P<0.05)。结论染色体异常是导致自然流产的主要原因之一,FISH和NGS应用于临床流产物遗传学分析各具优势,因此在临床应用中还应结合不同患者实际情况慎重选择,提高检测的准确性、防止漏诊,为临床评估再生育风险提供参考。     

二代测序在检测感染性心内膜炎患者心脏瓣膜组织病原体中的应用

目的评估二代测序(NGS)技术在检测感染性心内膜炎(IE)患者瓣膜中潜在病原菌的应用价值,为IE的诊断和术后治疗提供帮助。方法根据改良Duke标准,对IE患者和排除IE患者的瓣膜组织进行传统培养,同时应用NGS技术直接检测瓣膜组织上的病原菌,并将其检测结果与血培养、病理涂片染色结果进行比对。结果 NGS的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为95.0%、85.7%、95.0%和85.7%,血培养分别为30.0%、100.0%、100.0%、30.0%,瓣膜培养为10.0%、100.0%、100.0%、28.0%。结论与传统培养方法相比,NGS检测IE瓣膜赘生物的灵敏度更高,时间短。NGS对IE的诊断,尤其是培养结果为阴性疑似IE的诊断和治疗有较大的应用价值。     

中国首个着色性干皮病变异型家系的POLH突变研究

目的 检测一个着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,XP)家系的基因突变.方法 在2019年1—12月间,收集XP家系的临床资料和外周血标本,先证者采用新一代测序(next generation sequencing, NGS)进行测序,其余亲属采用Sanger测序验证.结果 在一个中国家系中发现了...     

基于宏基因组二代测序的聚集性发热事件病原体鉴定

目的 探讨宏基因组二代测序(m NGS)在聚集性发热事件病原体鉴定中的作用。方法 分析2020年4月25日本地区某学校某班级15例不明原因聚集性发热病例的临床特征及诊治。所有患者均给予常规病原学检测方法(细菌培养、抗原抗体检测、核酸检测等),并选择2例症状较重患者,行支气管肺泡灌洗液(BALF)宏基因组二代测序(m NGS)分析及细菌培养鉴定。结果 15例患者均有发热,打喷嚏5例,外周血白细胞升高10例,胸部CT提示肺部斑片状高密度影改变2例。所有患者Ig M抗体、Ig G抗体、流感病毒核酸、呼吸道病原体抗体谱(肺炎支原体、衣原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒Ig M抗体)、曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测(GM试验)、隐球菌乳胶凝集试验、全血细菌分离培养和鉴定结果均为阴性。BALF m NGS分析显示缓症链球菌基因组5个位点检测深度达100以上,3个位点达200以上,肺炎链球菌4个位点检测深度达100以上,但所有位点均未超过200。根据m NGS结果应用抗生素后,所有患者症状消失。BALF培养和鉴定亦为缓症链球菌。结论 此次不明原因聚集性发热事件的病原体为缓症链球菌,m N...