一个可能的与人端粒结合因子相互作用蛋白Tara的分离和克隆

目的:分离和鉴定端粒结合因子(TRF1)免疫共沉淀蛋白复合物并克隆其基因.方法:以TRF1抗体应用免疫共沉淀方法,从细胞蛋白抽提物中分离TRF1蛋白复合物,并作蛋白质肽指纹谱鉴定;应用温度梯度PCR,从人cDNA文库中扩增目的基因,并构建pEGFP-C2真核表达载体;核苷酸测序和Western blot验证目的基因序列和表达载体.结果:从TRF1免疫沉淀复合物中分离出了Tara蛋白;人cDNA文库中PCR扩增所得产物为1.7 kb,与Tara基因CDS序列同源性为99.9%;GFP/Tara融合蛋白约100 kD,Tara在间期HeLa细胞中弥散表达于胞浆,而有丝分裂细胞则定位于整个细胞.结论:Tara是一个可能的TRF1相互作用蛋白,其作用机制需进一步实验研究.     

TRF1 219位磷酸化在细胞周期调控中的作用研究

目的:研究端粒结合因子-1(TRF1)丝氨酸219位磷酸化对细胞周期的影响。方法:突变TRF1的219位氨基酸,构建模拟磷酸化和非磷酸化状态的突变体TRF1S219D-GFP和TRF1S219A-GFP,核苷酸测序和免疫印迹验证目的基因序列及蛋白表达。将野生型和突变体质粒用脂质体转染法转入H eLa细胞,观察它们在细胞中的定位、流式细胞仪检测各细胞周期的细胞数量、免疫印迹检测转染后ATM蛋白水平的改变。结果:测序证实突变成功,GFP抗体免疫印迹证实了突变体的蛋白表达。荧光显微镜下观察到TRF1S219A-GFP和TRF1S219D-GFP均呈点状定位于细胞端粒。流式细胞仪结果显示,过表达野生型和非磷酸化突变体的H eLa细胞产生G 2/M期的阻滞(P<0.05)。转染野生型和突变体后H eLa细胞中ATM蛋白含量均比对照组增高。结论:ATM激酶对TRF1丝氨酸219位的磷酸化可以抑制由于TRF1过量表达而引起的细胞周期G 2/M期的阻滞。     

端粒、端粒酶与食管癌

在上个世纪 30年代 ,遗传学家Muller和Mc Clintock提出了端粒 (telomere)的概念 ,70年代Greider和Blackburn在四膜虫中证实端粒结构为简单的TTGGGG核苷酸重复序列[1 ] ,1 984年Greider和Blackburn又在四膜虫中发现了端粒酶(telomerase) [2 ] 。近几年对端粒和端粒酶的研究十分活跃 ,现就端粒和端粒酶的一些进展及其在食管癌方面的研究予以阐述。1　端粒 (telomere)端粒是位于真核细胞染色体末端的一种由 2～ 2 0kb串联的短片段重复序列 (TTAGGG) n 及一些结合蛋白组成的特殊结构 ,在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面…     

端粒、端粒酶与血液系统肿瘤

端粒与端粒酶的结构和功能 1.1 端粒(Telomere)是真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合物.人类端粒重复序列为5'-TTAGGG-3',长度在体细胞约5～15kb,精子细胞15kb,外周血细胞10kb,它能防止染色体DNA降解、末端融合和非正常重组及染色体缺失,使体细胞不能无限增殖.体细胞DNA每复制一次其末端DNA即可丢失50～200bp,这与精子细胞有所不同.端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白质组成的特殊核糖核蛋白复合体,具有逆转录酶活性,能以自身RNA为模板(5'-CUAACCCUAAC-3')合成端粒.人端粒酶主要包括三部分,即人端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(TP1/TP2)、人端粒酶催化亚单位(hTRT/hEST2).在正常人体细胞中端粒酶活性表达受抑,而在肿瘤形成时可被激活.因此,在某些永生细胞和肿瘤细胞中随着DNA的复制,其端粒酶不会缩短.     

端粒酶在乳腺癌中的表达研究

目的探讨端粒酶活性检测在乳腺癌临床诊治中的意义。方法采用TRAP-assay法检测了人乳腺癌及癌旁正常组织中端粒酶活性。结果细胞株HeLa细胞、K562细胞端粒酶活性均为阳性表达，26例乳腺癌组织端粒酶活性均阳性表达(其中4例呈弱阳性)，24例癌旁组织中5例呈弱阳性，19例呈阴性，而lysis buffer及阴性对照均呈阴性反应。结论端粒酶在人乳腺癌的发生与发展中可能起着重要作用，提示端粒酶活性测定可用于乳腺癌的早期诊断。     

端粒及端料酶与白血病

端粒和端粒酶是近年来肿瘤基础研究的热点课题之一 ,端粒酶的激活与端粒长度的维持是细胞永生化和无限制增殖的基础。最近的研究提示 ,细胞染色体端粒行为和端粒酶表达的异常在肿瘤发展中起重要的作用 ,现就白血病的端粒行为、端粒酶表达异常及其意义作一综述。1　端粒端粒是位于真核生物细胞染色体末端的特殊结构 ,它由ＤＮＡ和蛋白质组成[1,2 ] 。人类端粒含有几千拷贝的六聚体重复序列 ,是一个简单重复的富含鸟苷酸 (Ｇ)的ＤＮＡ序列[3 ] ,重复单位是 ( 5’ -ＴＴＡＧＧ -3’)ｎ ,端粒对染色体的稳定及其基因组的完整非常重要 ,为染色体…     

人端粒重复序列结合因子在急性白血病细胞中的表达及与端粒酶活性的关系

目的:研究人端粒重复序列结合因子(TRF1)在30例急性白血病细胞中的表达,了解TRF1表达与急性白血病分型的关系,以及与端粒酶活性的关系.方法:用荧光定量RT-PCR定量检测30例急性白血病细胞中TRF1 mRNA表达情况,同时检测hTERT mRNA的表达,并分析两者之间的相关性.结果:TRF1在急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)细胞中的表达0.0126(0.0127～0.0546)明显低于正常人骨髓单个核细胞中的表达0.0457(0.00839～0.262)(P<0.001),但在急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞中的表达0.0745(1.92×10-6～0.193)与正常人骨髓单个核细胞比较差异无显著性,且在ANLL细胞中的表达明显低于ALL细胞中的表达(P=0.001).TRF1和hTERT在急性白血病细胞和正常人骨髓单个核细胞中的表达无显著相关性(r=-0.173,P=0.207).结论:TRF1 mRNA在ANLL细胞中表达明显降低,而在ALL细胞中表达无显著改变,提示ANLL细胞中TRF1可能通过调控端粒长度对端粒酶起间接负调控作用.     

端粒酶与消化系肿瘤相关性研究进展

端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构 ,在稳定染色体及防止染色体在复制时缩短等方面具有重要作用。端粒酶是催化合成并维持端粒一定序列的一种核糖核蛋白。端粒酶与肿瘤的关系已成为近年来肿瘤分子生物学领域最热门的课题之一。现就端粒酶的结构和功能及其在消化系肿瘤中的研究现状作一踪述。1　端粒、端粒酶的结构和功能　　端粒是位于真核细胞染色体末端的一种富含鸟嘌呤的 DNA-蛋白复合体。人类染色体端粒由 5’TTAGGG3’序列片段重复构成 ;不同细胞端粒长度不一 ,平均约为 1 0 kb。端粒的主要作用是参与 DNA复制、染色体位移及维…     

端粒,端粒酶与造血细胞

端粒（telomere）是以TTAGGG六个碱基序列成百上千次重复组成的染色体末端结构，其主要功能有二：①保扩染色体免受核酶降解、防止染色体断端融合及杂色体重排；②控制细胞分裂次数的生物钟；每次细胞分裂均会丢失50－200个碱基端粒片段，当细胞分裂增殖使端粒长度缩短到一定限度如4kb以下时，细胞或是丧失分裂增殖能力而调亡，或是重新表达高活性的端粒酶（Telomerase），恶变为癌细胞，以维持细胞增殖所需要的端粒长度，达到无限分裂增殖[1]；正常体细胞体外导入端粒酶基因，使其表达高活性的端粒酶，细胞的增殖能力增强、衰老延迟[2]…     

急性白血病细胞端粒结合蛋白2表达的研究

目的研究人类白血病细胞株及原代白血病细胞中人端粒结合蛋白2(TRF2)的表达.方法应用实时定量RT-PCR,检测白血病细胞株及原代白血病细胞中TRF2 mRNA的表达,应用Western Blot,检测TRF2蛋白的表达.结果T淋巴系白血病细胞株的TRF2表达显著高于骨髓单个核细胞和髓系白血病细胞株.在原代白血病细胞中,M0和M1亚型患者白血病细胞TRF2的表达高于其他各亚型急性髓系白血病(AML)患者.结论预后差的AML患者和T细胞恶性肿瘤细胞株高表达TRF2,提示TRF2高表达可能和白血病的预后有关.     

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体的构建和鉴定

目的 利用端粒酶逆转录酶基因启动子,构建能在人肿瘤细胞中特异表达目的基因的表达载体。方法 通过PCR方法从pEGFP-N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白基因并克隆到逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点上,命名为pLNCX-EGFP。设计含有特定酶切位点的引物,从人基因组中扩增出端粒酶逆转录酶基因启动子序列,将该序列片段定向克隆到已用限制性内切酶切除巨细胞病毒启动子的pLNCX-EGFP载体上,构建成端粒酶逆转录酶基因启动子调控的含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体pLNT-EGFP。将该表达载体pLNT-EGFP瞬时转染高表达端粒酶活性的HLF细胞株和不表达端粒酶活性的WI38细胞株,以检测端粒酶逆转录酶基因启动子的转录活性。结果 表达载体pLNT-EGFP经酶切、测序分析证实与设计的完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pLNT-EGFP能特异地在端粒酶阳性细胞中高效表达绿色荧光蛋白报告基因,而在端粒酶阴性细胞中不表达报告基因。结论 成功构建了由端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞靶向表达载体。     

CHK1 shRNA对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默CHK1基因的表达,观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建针对CHK1的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,将该质粒通过脂质体转染法导入HeLa细胞,以RT-PCR和Western blot法分别检测其CHK1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖.结果 shRNA能明显降低HeLa细胞表面CHK1的表达,与对照组和空载体转染组相比, shRNA转染组HeLa细胞CHK1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%(P<0.05).此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低, 而且G2/M期细胞百分率显著下降.对照组、空载体转染组和shRNA转染组的G2/M期细胞百分率分别为(53.96±1.35)%、(54.08±1.39)%和(15.10±0.87)%(P<0.05).结论 CHK1shRNA能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,削弱其G2/M期阻滞,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供实验基础.     

补肾填精复方对WI38细胞周期及相关基因表达的影响

目的:观察补肾填精中药复方对衰老细胞周期及相关基因表达的影响.方法:选用衰老细胞模型WI38常规培养至33代,加入补肾填精复方含药血清作用至40代,并以流式细胞仪、RT-PCR、wester-blot等方法检测补肾填精含药血清对衰老细胞周期及相关基因表达影响.结果:33代后传代细胞出现明显衰老特征;衰老细胞阻滞于G1期;补肾填精含药血清可以延缓WI38细胞衰老,促进细胞进入细胞周期;补肾填精含药血清可降低细胞衰老相关基因P53、P21、P16转录与表达水平.结论:补肾填精中药复方可以影响细胞周期,减缓细胞衰老,其作用的环节可能与降低细胞衰老相关基因P53、P21、P16表达水平相关.     

携带GFP和FLAG标签的真核表达载体介导细胞珠蛋白在细胞内表达的定位研究

目的分别构建带有绿色荧光GFP标签和带有FLAG标签的细胞珠蛋白(CYGB)真核表达载体,观察其在人肝星状细胞(LX-2)的表达定位情况,探讨细胞珠蛋白经不同载体介导表达的定位差异。方法提取人肝癌细胞(HepG2)总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得CYGB的cDNA,以cDNA为模板采用PCR法扩增得到CYGB编码序列。将其酶切后分别连接至带有GFP标签和FLAG标签的载体上,酶切与测序鉴定阳性克隆。随后将重组质粒分别瞬时转染LX-2细胞,Western blot鉴定表达情况。利用细胞免疫荧光定位,在荧光显微镜下观察两组定位差异。结果双酶切和测序鉴定表明pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG真核表达载体构建成功;经Western blot鉴定,转染的两个载体都能够在LX-2细胞中表达融合蛋白;通过荧光显微镜发现,pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG介导的表达产物分别定位在整个细胞和细胞质中。结论可能由于GFP分子量大等多种原因,导致带GFP标签的融合蛋白定位与带FLAG标签的定位不同,带FLAG标签的融合蛋白定位结果更加可信。     

胃癌端粒酶活性与肿瘤细胞增殖活性的研究

目的研究胃癌端粒酶活性和肿瘤细胞增殖活性的关系.方法用端粒重复扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测40例胃癌及癌旁组织的端粒酶活性,用流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞的增殖指数(PI)和S期细胞比率(SPF).结果肿瘤端粒酶阳性率为87.5%,癌旁组织阳性率为5.0%.两者有显著性差异.胃癌端粒酶活性与年龄、性别和分化程度无关,而与肿瘤大小和淋巴结转移状况有关.胃癌端粒酶表达阳性者较阴性者PI和SPF明显升高.结论胃癌端粒酶活性是判断肿瘤恶性程度的指标.与肿瘤细胞增殖活性有关.     

p53301-393突变体的细胞定位及对有丝分裂的影响

目的:研究p53N端缺失突变体(301-393氨基酸)的绿色荧光融合蛋白p53301-393-GFP在p53阳性和阴性细胞中的定位以及对有丝分裂的影响。方法:免疫印迹检测突变体融合蛋白的表达。将野生型p53-GFP和p53301-393-GFP质粒,分别转染p53阳性细胞株HeLa和p53阴性细胞株H1299,观察各融合蛋白的细胞定位。观察转染突变体后H1299细胞生长情况,计数有丝分裂期的细胞数。HeLa细胞转染突变体后,流式细胞仪检测细胞周期,免疫印迹检测p53蛋白水平的改变。结果:p53301-393-GFP融合蛋白能正确表达。突变体在p53阳性和阴性细胞中都弥散定位于细胞核,但只在p53阳性细胞中才定位于核仁。p53301-393-GFP融合蛋白对H1299细胞的有丝分裂有明显的抑制作用,使进入有丝分裂期的细胞数量明显较对照组减少,且能够诱导凋亡。转染突变体的HeLa细胞产生G2/M期阻滞(P<0.05),但是内源性p53蛋白水平无明显改变。结论:p53301-393-GFP突变体在p53阳性和阴性细胞中有不同的细胞定位,并能抑制细胞的有丝分裂,使细胞发生G2/M期阻滞。