肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

携带跨膜信号的凋亡蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建携带跨膜信号序列的凋亡蛋白（apoptin）的原核表达载体PET-28a（＋）-apoptin,诱导表达并纯化重组apoptin蛋白,制备多克隆抗体。方法用多重PCR的方法扩增跨膜信号序列（PTD）及apoptin的编码序列,构建原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,转化大肠杆菌BL21（DE3）,低温条件下IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法鉴定蛋白表达,经镍亲和层析方法纯化目的蛋白后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体。结果DNA测序鉴定表明成功构建了原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经低温和IPTG诱导后,获得重组apoptin蛋白,制备的多克隆抗体经ELISA方法和免疫印迹法证实能特异性地识别apoptin。结论成功获得了携带跨膜信号序列的重组蛋白apoptin及其多克隆抗体,为进一步研究其特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能及相关机制奠定了基础。     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

舌鳞癌和涎腺腺样囊性癌细胞株中MAGE-1和MAGE-3基因的表达

目的：观察肿瘤特异性抗原基因MAGE－1、MAGE－3在人舌鲜癌细胞株Tca-8113、人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC－2和ACC－M中的表达状况，以评价这些基因作为舌鳞癌和涎腺腺样囊性癌的免疫学检测和免疫治疗、基因治疗分子标志物的可行性。方法：采取Tca-8113、ACC－2和ACC-M细胞株培养后，用Trizol试剂提取总RNA，逆转寻合成cDNA，而后应用聚合酶链反应扩增目的片段，经琼脂糖凝胶电泳确认目的片段。以GAPDH基因作为检测内对照，并与正常组织比较。结果：在人舌鳞癌细胞株Tca-8113、人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC－2和ACC－M中，MAGE－1、MAGE－3基因均有表达。在正常组织中未见上述基因的表达。结论：MAGE－1、MAGE－3基因有可能作为舌癌和涎腺腺样囊性癌免疫学检测的分子标志物，并且具有作为免疫治疗、基因治疗特异性靶位的潜在价值。     

MAGE-3逆抗原转染树突状细胞的抗胃癌免疫效率

目的构建逆抗原表达载体,以获得理想的肿瘤疫苗。方法运用RT-PCR方法合成MAGE-3cDNA,分别将RANTES基因分泌段前导序列和受体Fc段克隆至MAGE-3cDNA两端(pS-MAGE-3-Fc)再转染入DC表达,将致敏的DC与外周血T细胞和胃癌细胞共培养,观察产生的免疫效应。结果转染pS-MAGE-3-Fc的DC诱导的刺激淋巴细胞增殖反应和CTL杀伤效应均显著高于转染pMAGE-3的转染组和对照组(P<0.05)。结论逆抗原策略是理想的肿瘤疫苗策略,能够显著提高肿瘤免疫效率。     

MAGE-3逆抗原转染树突状细胞的抗胃癌免疫效率

目的 构建逆抗原表达载体,以获得理想的肿瘤疫苗.方法 运用RT-PCR方法合成MAGE-3 cDNA,分别将RANTES基因分泌段前导序列和受体Fc段克隆至MAGE-3 cDNA两端(pS-MAGE-3-Fc)再转染入DC表达,将致敏的DC与外周血T细胞和胃癌细胞共培养,观察产生的免疫效应.结果 转染pS-MAGE-3-Fc的DC诱导的刺激淋巴细胞增殖反应和CTL杀伤效应均显著高于转染pMAGE-3的转染组和对照组(P＜0.05).结论 逆抗原策略是理想的肿瘤疫苗策略,能够显著提高肿瘤免疫效率.     

肺癌组织中黑色素瘤抗原-3基因mRNA的表达

目的：检测肺癌组织中黑色素瘤抗原－3基因（MAGE－3）mRNA的表达，方法；用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－PCR）对31例肺癌患者癌组织和相应癌旁组织MAGE－3 mRNA表达情况进行测定；PE－377DNA测序仪对5例10个RT－PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：31例肺癌患者癌组织中26例表达MAGE－3 mRNA，阳性率为83.9%；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明PCR扩增产物中目的基因片段均为MAGE－3 cDNA序列，所测5例样本中4例样本有2个相同位置的碱基发生了点突变，导致一个氨基酸残基改变。结论：（1）MAGE－3 mRNA在肺癌中呈高比例表达，提示此抗原有可能作为肺癌患者免疫治疗的靶抗原；（2）我国肺癌患者中存在MAGE-3基因个别位点的变异。     

人MAGE-3基因片段的克隆与测序

目的克隆表达人MAGE-3基因片段(210～623位碱基),以便研究其对MAGE-3阳性恶性肿瘤的生物学作用。方法为选择靶基因,采用分子生物学软件分析MAGE-3基因抗原表位;并设计MAGE-3靶区域引物。从人肺癌组织标本中提取mRNA,用RT-PCR法从中扩增出MAGE-3片段,对其进行XhoⅠⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-TEasy载体中,转化JM109,进行阳性筛选后,运用pGEM-TEasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果抗原表位分析表明MAGE-3基因片段(210～623位碱基)为抗原决定簇丰富区段。RNA体外扩增得到的片段为414bp,并经XhoⅠⅡ酶切鉴定得到证实;pGEM-TEasy-MAGE-3经筛选鉴定正确,DNA测序结果与Genebank比较完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-TEasy。结论该片段可用于真核及原核表达。     

非小细胞肺癌MAGE-3抗原的表达

【目的】检测MAGE 3基因编码的抗原在非小细胞肺癌表达的情况 ,探讨利用MAGE 3抗原对非小细胞肺癌患者进行特异性免疫治疗的可能性。【方法】用免疫组化LSAB的方法对石蜡包埋的组织切片进行MAGE抗原的检测。【结果】 10 4例非小细胞肺癌原发灶肿瘤组织切片中 ,MAGE 3抗原阳性的有 31例 ,阳性率 2 9 8%。【结论】有相当部分非小细胞肺癌患者的肿瘤表达MAGE 3抗原 ,这些患者可能是进行MAGE 3基因编码的抗原介导的免疫治疗的合适人选。     

黑素瘤抗原-3 基因及蛋白在非小细胞肺癌中的表达

目的 检测黑素瘤抗原-3(MAGE-3)mRNA及其编码的肿瘤抗原在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨以该抗原作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性.方法 用RT-PCR方法和流式细胞术(FCM)对3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE-3 mRNA及蛋白的表达情况进行研究.结果 3种人肺癌细胞系均表达MAGE-3mRNA及蛋白;56例NSCLC标本中,30例表达MAGE-3 mRNA,26例表达MAGE-3蛋白,而相邻正常肺组织均不表达MAGE-3mRNA或蛋白.结论 MAGE-3 mRNA及蛋白在NSCLC中具有较高的表达频率,提示该抗原有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点.     

黑色素瘤抗原-1基因并进行序列分析

目的:克隆黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因并进行序列分析.方法:从人肝细胞性肝癌(HCC)组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出MAGE-1基因,酶切鉴定后将其插入pGEM-T easy载体,对其进行序列测定并与GenBank中已知序列进行同源性分析.结果:所克隆的MAGE-1基因与GenBank 中的MAGE-1基因序列相比较,仅有4个碱基存在差异,同源性为99.7%,而且仅有1处碱基差异引起了氨基酸改变.结论:从人HCC组织中成功克隆了MAGE-1基因.