实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

耐利福平结核分枝杆菌 rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ突变的研究

目的：了解结核分枝杆菌rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ突变特征及其与利福平耐药的关系。方法对140株临床分离结核分枝杆菌进行利福平敏感性试验,并对耐利福平株分别进行rpoB耐药决定区及rpoA、rpoB、rpoC及rpoZ全基因测序。结果140株结核分枝杆菌中57株对利福平耐药。57株耐利福平结核分枝杆菌中,52株（91.2%）存在突变,其中50株为rpoB基因突变,2株为rpoC突变。在rpoB 765、1001、1156位及rpoC 51位发现新的突变位点。结论结核分枝杆菌对利福平耐药主要与rpoB和rpoC基因突变有关。     

结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法的建立

目的建立结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变的快速检测方法。方法根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列，自行设计覆盖rpoB、katG、inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针，并检测临床样品中结核分枝杆菌的基因突变情况，以此来判断耐药结果。结果在56个利福平耐药菌株中，有50个菌株都在rpoB基因上榆出有突变，利福平耐药突变检出率为89．3％（50／56）；有30个利福平敏感菌株rpoB基因上都未检出突变。有58个异烟肼培养的耐药菌株中有47个在katG或inhA基因上检出有突变，异烟肼耐药突变检出率为81．0％（47／58）；有30个异烟肼敏感菌株katG或inhA基因上未检出突变。结论用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核分枝杆菌耐药性的检测。     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

应用多重PCR-单链构象多态性分析同时检测耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR-单链构象多态性分析(multiplexpulymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,multi-PCR-SSCP)方法快速、特异地同时快速检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的效能.方法 根据结核分枝杆菌的inhA序列、katG序列、rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物.采用multi-PCR-SSCP技术,一次性检出耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌.新方法的有效性通过116株临床分离株(70株耐异烟肼,66株耐利福平)的验证.结果 名 Multi-PCR-SSCP方法检测临床分离株基因突变的有效性,以细菌培养和药敏试验结果为金标准.116株临床分离株和H37Rv标准株中除了4株katG缺失突变,其余菌株3个基因katG、inhA和rpoB在单基因PCR中都扩增成功.与H37Rv标准株相比,46株katG基因突变,14株inhA基因突变,58株rpoB基因突变.38株katG和rpoB,4株inhA和rpoB,4株inhA和katG同时突变,还有2株3个基因都有突变.multi-PCR-SSCP对于耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌检出的敏感度分别为80%、82%,特异度分别为100%和92%.结论 multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测耐多药结核分枝杆菌,有望成为临床指导用药的好方法,为深入研究耐药基凶检测奠定了良好的基础.     

临床分离结核分枝杆菌耐药性质与rpoB、rpsL基因变异的研究

目的:对从疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌的rpoB和rpsL基因突变情况进行研究,分别探讨其与耐利福平(RFP)和耐链霉素(SM)之间的关系.方法:采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株和1株卡介苗株(BCG)的rpoB和rpsL基因进行序列分析.结果:分离得到耐利福平27株,耐链霉素25株,经测序分析,所有利福平、链霉素敏感株rpoB、rpsL基因均未发生氨基酸突变;RFP和SM耐药株rpoB和rpsL基因的突变率各为81.5％(22/27)和76％(19/25);耐利福平以Ser531Leu突变最为常见,突变频率为55.6％(15/27),耐链霉素以Lys43Arg位突变最为常见,突变频率为72.0％(18/25).结论:rpoB和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌RFP和SM耐药性.     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。     

PCR-DNA测序技术检测结核分支杆菌耐多药基因突变的研究

目的应用PCR—DNA测序技术快速检测同时耐利福平和异烟肼结核分支杆菌分离株rpoB、KatG基因突变，评价其在检测结核分支杆菌耐多药性方面的价值。方法47株耐利福平和异烟肼结核分支杆菌临床分离株及30株结核分支杆菌敏感分离株用PCR—DNA测序技术分别检测rpoB、KatG基因突变。结果47株耐多药结核分支杆菌分离株中，检出43株rpoB基因突变，突变检出率为91．5％（43／47）；31株KatG基因突变，突变检出率为66．0％（31／47）；rpoB和KatG基因同时突变者31株，突变检出率为66．0％（31／47）。30株结核分支杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR—DNA测序技术方法敏感、准确、特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG耐药基因突变，有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

目的用聚合酶链反应（PCR）一直接测序法检测肺结核患者临床痰分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变：了解耐药分子机制及探索痰标本结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）、利福平（RFP）直接检测的可行性。方法对47例耐INH、RFP的结核分枝杆菌临床痰分离株行PCR一直接测序法检测KatG及rpoB基因突变。结果47例耐INH、RFP分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29／47（61．7％）、43／47（91．5％），两者同时突变26例（55．3％）。结论PCR一直接测序法敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变，适合于临床肺结核患者痰标本耐药性的快速检测。     

错配PCR技术在快速检测耐药结核分枝杆菌中的应用

耐药结核病的早期快速诊断是结核病控制中亟待解决的关键问题之一。利用基因型检测耐药性包括PCR产物直接测序法，错配PCR法等。错配PCR技术最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查，目前已广泛应用于基因点突变的检测。根据PCR引物设计的不同，可将其分为间接错配PCR，即引物与野生型完全互补，以突变株为模板不能扩增得到PCR产物，和直接错配PCR，即引物与特定的点突变完全互补，以野生株为模板不能扩增得到PCR产物。已有用间接错配PCR方法检测结核分枝杆菌利福平耐药的报道。本研究以检测耐利福平的结核分枝杆菌rpoB基因531位点的点突变为对象，建立了直接错配PCR法，并与间接错配PCR法进行了比较。     

PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

肺结核与结核性脑膜炎病例中结核分枝杆菌耐利福平相关基因突变分布分析

目的分析结核性脑膜炎与肺结核病例中,导致结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因突变分布规律及差异。方法对包含利福平耐药决定区81bp的102株结核分枝杆菌临床分离株的PCR产物进行测序分析。结果 102株利福平耐药的结核分枝杆菌的rpoB基因测序发现,63株导致肺结核的结核分枝杆菌的rpoB基因突变常见位点为:531(53.97%),526(20.63%),516(6.45%)。39株导致结核性脑脑膜炎的rpoB基因突变最常见位点为:531(61.54%),526(20.51%),533(7.69%)。结论导致结核性脑膜炎与导致肺结核的结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的最常见两个突变位点(531和526)无显著差异。其中531位密码子的Ser-Leu突变率占明显优势。     

病原生物学检验与临床

下呼吸道感染患者临床分离病原菌的分析；539例尿路感染的实验室检查分析；耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因检测分析；结核分枝杆菌ropB基因突变特征的初步探讨；实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用；rpoB基因点突变与结核分枝杆菌对利福平耐药相关性的研究；PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分枝杆菌耐药基因的检测；     

结核分支杆菌rpoB基因突变与对利福平耐药的关系

目的:研究结核分支杆菌耐利福平(RFP)分离株rpoB基因突变情况并评价英应用价值.方法:采用多聚合酶链式反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP法)对60株结核分支杆菌rpoB基因进行检测.结果:以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照,60株PCR扩增阳性的结核分支杆菌中,共有32株发生突变,总突变率为53.3%(32/60);24株药物敏感株有4株rpoB基因有突变,突变率为16.7%;36株耐药株中,28株rpoB基因有突变,突变率为77.8%.耐药菌株突变率明显高于敏感菌株的突变率(P<0.05).结论:rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制;应用PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性.     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种判定菌阴肺结核患者是否对利福平有无耐药性的方法。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养。结果112例活动性肺结核患者痰标本39例为菌阴(涂阴培阴),39例菌阴痰中套式PCR扩增18例呈阳性,产物DNA测序2例有rpoB基因突变,位点为第526发生了CAC→GAC突变和第531发生了TCG→TTG突变。20例非结核性肺部疾病患者标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测菌阴肺结核患者临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

近年来,由于结核病疫情的快速上升,耐多药结核（至少耐异烟肼、利福平两种以上抗结核药）患者的增多,严重地影响了结核病的化学治疗效果,从而给结核病的控制带来了极大的困难,目前临床常用痰培养法来检测结核分枝杆菌的耐药性,但所需时间长,无法满足临床医生的需要,因此快速检测结核分枝杆菌耐药基因并用来指导临床治疗是一种新的探索。近几年的研究证实异烟肼（INH）、利福平（RFP）的耐药性与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG、RNA聚合酶的B亚基的编码基因rpoB基因突变有关。我们采用聚合酶链反应（PCR）——直接测序法作为检测KatG及rpoB基因突变的方法,用于检测基因点突变,了解基因突变情况,探索其在结核分枝杆菌INH、RFP耐药性测定方面的价值及直接用于临床痰标本检测的可行性。由于不需要特殊的仪器,更为简便、快速、灵敏,适合临床工作的需药要,现将我们的研究报告如下。     

菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的检测

目的 应用套式PCR-DNA测序方法直接检测菌阴肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种判定菌阴肺结核患者是否对利福平有无耐药性的方法.方法 采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况.同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养.结果 112例活动性肺结核患者痰标本39例为菌阴(涂阴培阴),39例菌阴痰中套式PCR扩增18例呈阳性,产物DNA测序2例有rpoB基因突变,位点为第526发生了CAC→GAC突变和第531发生了TCG→TTG突变.20例非结核性肺部疾病患者标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%.结论 套式PCR-DNA测序可望为直接检测菌阴肺结核患者临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法.