体外早期培养兔脂肪源性间充质细胞的增殖能力

背景:最新研究表明人脂肪源性间充质细胞的表面标志分子及分化能力会随着培养时间的延长而有所改变。目的:观察体外早期培养的兔脂肪源性间充质细胞形态学特点及集落形成能力。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/03在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科研究所和中心实验室完成。材料:3月龄雌性新西兰大白兔9只,由上海市银根养兔室提供。方法:兔麻醉后取颈背处的皮下脂肪,I型胶原酶消化法获得原代细胞,接种至含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液中,细胞达80%融合时传代,取第2,3,4代细胞用于实验。主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型,计数细胞集落形成率。结果:第2,3,4代兔脂肪源性间充质细胞均呈成纤维细胞样生长,体外生长迅速,CD29及PCNA均呈阳性表达,集落形成率分别为(8.0±0.6)%,(6.7±0.4)%,(4.6±0.5)%,经方差分析差异有显著性意义(F=12.18,P<0.05)。结论:体外早期培养的兔脂肪源性间充质细胞生长增殖旺盛,集落形成能力随着传代次数增加呈显著下降趋势。     

胎鼠皮肤间充质干细胞体外增殖特性的研究

目的探讨胎鼠皮肤间充质干细胞的体外增殖特性。方法取昆明小鼠胎鼠皮肤体外培养胎鼠皮肤间充质干细胞,MTT法检测所培养细胞对表皮生长因子(EGF)、角朊细胞生长因子(KGF)和碱性或纤维细胞生长因子(bFGF)的反应,观察其在体外培养条件下的增殖与生长特征。结果胎鼠皮肤间充质干细胞具有很强的增殖活性,传代培养潜伏期为24-48 h,对数增殖期为3-5 d,然后进入平台期。经过15代连续培养的细胞其增殖能力未见明显改变。应用MTT法检测发现,培养的细胞对bFGF具有良好的反应性,并在1.0μg.L-1时反应最强,而对KGF和EGF的反应不明显。结论培养的胎鼠皮肤来源细胞增殖能力强;为间充质来源的干细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及多向诱导分化

背景:间充质干细胞不仅自身免疫原性弱,还可以调节细胞免疫功能,减轻移植物排斥反应,在组织工程中具有良好的应用前景.但骨髓中间充质干细胞含量稀少,约占单个核细胞的十万分之一到百万分之一.目的:建立一种分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,观察体外培养骨髓间充质干细胞的生长特性,及其潜在的诱导分化能力.方法:采用灌流法获取兔胫骨骨髓,密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增,相差显微镜观察其形态学特点,MTT法测定绘制传代骨髓间充质干细胞生长曲线,经成骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,0.1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L抗坏血酸,10 mmol/L β-甘油磷酸钠)、成脂诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,1 μmol/L地塞米松,200 μmol/L吲哚美辛,0.5 mmol/L IBMX,10 mg/L胰岛素)、成软骨诱导液(L-DMEN/F12,体积分数为10%胎牛血清,10 μg/L转化生长因子β1,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L抗坏血酸,6.25 mg/L胰岛素)体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化,并分别经碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色法鉴定.结果与结论:通过密度梯度离心法联合贴壁培养法可在体外大量扩增、纯化骨髓间充质干细胞,所获细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能,原代及传代骨髓间充质干细胞为梭形.经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红色脂滴,经成软骨细胞诱导,甲苯胺蓝染色阳性.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的探讨兔骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法。方法全骨髓贴壁法提取兔骨髓中的间充质干细胞,流式细胞术检测细胞表面分子CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD90等标志的表达以及不同代次兔BM-SCsDNA含量。通过定向分化检测兔BMSCs的多向分化潜能。结果兔骨髓间充质干细胞呈形态较为均一的小梭形、克隆样生长。流式细胞术检测结果显示,传代至第12代和20代的兔骨髓间充质干细胞检测对数生长期细胞的DNA含量结果显示细胞为正常二倍体细胞,无明显变异。细胞表面表达CD29（61.71%）、CD44（60.2%）,不表达CD14（0.4%）、CD34（0.34%）、CD45（0.64%）和CD90（0.04%）。兔BMSCs的定向分化结果显示其可向成骨细胞、脂肪细胞及成软骨细胞分化。结论成功获得具有多向分化潜能的兔骨髓间充质干细胞,其具有特定的细胞表面抗原,具有容易获取、增殖能力强等特点,是优良的组织工程种子细胞。     

人牙髓细胞体外培养的实验研究

目的 建立人牙髓细胞体外培养模型并研究特异性波形丝蛋白在培养细胞中的表达.方法 采用组织块法体外培养人牙髓细胞,取新鲜拔除的无龋、无感染的智齿或正畸牙的牙髓.结果 经7～8d,在组织块周围有细胞游出,14d后细胞铺满瓶底,可以进行传代.一般可传5～8代.持续生长40d左右.SABC免疫组织化学检测培养细胞波形丝蛋白的表达阳性.结论 通过组织块法可以成功培养人牙髓细胞,为牙髓细胞的进一步研究奠定了生物学基础.     

兔脂肪间充质干细胞向胰岛素样分泌细胞分化及鉴定

脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）最早由Zuk[1]等人于2001年从抽脂术中抽取的脂肪组织中分离培养,近年来已成为医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点.ADSCs是一种来源于脂肪组织中的多能干细胞,和骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）类似,也有很强的增殖能力和分化潜能.ADSCs能在不同的诱导微环境下向不同的组织细胞（如脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞、心肌细胞和神经细胞等）分化[1].本实验在体外分离培养兔的脂肪间充质干细胞,通过相应的试剂使其诱导分化为类胰岛素分泌细胞,并研究其生物学特性,以期为临床采用ADSCs治疗Ⅰ型糖尿病提供理论依据.     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化

背景:骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。目的:观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法:冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和VonKossa银染色了解细胞钙化情况。结果与结论:兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和VonKossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响

背景:人骨髓间充质干细胞的增殖和分化可以修复组织器官损伤,随着年龄增长人体组织修复能力减弱,是否人骨髓间充质干细胞增殖能力随年龄增长而减弱尚不清楚.目的:观察年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响.方法:15份骨髓标本来源于青岛市中心医院骨折或行髋关节置换患者,其中儿童、成年人、老年人各5例,年龄分别为7～12岁,20～55岁,60～90岁.抽取人骨髓组织,采用密度梯度离心法分离出单核细胞并接种于培养瓶内,在第5天计数集落形成单位;当贴壁细胞融合后进行传代,第1代细胞分两种方式进行培养:192个细胞接种于2个96孔板观察单细胞克隆形成能力,12 500个细胞以5×103/cm2接种于培养瓶内并以此密度连续传代观察细胞增殖率.结果与结论:不同年龄人群骨髓间充质干细胞体外培养集落形成单位和细胞增殖率无明显区别(P > 0.05),但单细胞克隆形成能力随年龄增长而下降(P < 0.01).提示骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力没有随年龄的增长而下降,但其中能形成单细胞克隆未定向干细胞的数量随年龄的增长而减少.     

体外早期培养免脂肪源性间充质细胞的增殖能力

背景:最新研究表明人脂肪源性间充质细胞的表面标志分子及分化能力会随着培养时间的延长而有所改变.目的:观察体外早期培养的兔脂肪源性间充质细胞形态学特点及集落形成能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/03在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科研究所和中心实验室完成.材料:3月龄雌性新西兰大白兔9只,由上海市银根养兔室提供.方法:兔麻醉后取颈背处的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法获得原代细胞,接种至含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液中,细胞达80%融合时传代,取第2,3,4代细胞用于实验.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型,计数细胞集落形成率.结果:第2,3,4代兔脂肪源性问充质细胞均争成纤维细胞样生长,体外生长迅速,CD29及PCNA均呈阳性表达,集落形成率分别为(8.0±0.6)%. (6.7±0.4)%. (4.6±0.5)%,经方差分析差异有显著性意义(F=12.18,P<0.05).结论:体外早期培养的兔脂肪源性间充质细胞生长增殖旺盛,集落形成能力随着传代次数增加呈显著下降趋势.     

人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化

背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后,制成单细胞悬液,加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养,传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示,诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1,Col-Ⅰ,牙本质涎蛋白表达阳性外,还有巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性,而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞,在一定的诱导培养条件下,牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。     

牙髓成纤维细胞体外培养及增殖的实验研究

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对体外培养人牙髓细胞增殖活性的影响.方法:以改良组织块培养法体外获得人牙髓细胞,以细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit8,CCK-8)研究bFGF在不同浓度(1.0、5.0、10.0和50.0 ng/mL)、不同时间(1、2、4和7 d)作用下,牙髓细胞增殖活性的变化.结果:bFGF在1.0～50.0 ng/mL浓度下可促进体外培养人牙髓细胞的增殖(P<0.05),bFGF促进牙髓细胞增殖的最低显效浓度为1.0.g/mL,最佳显效浓度为10.0 ng/mL.从第2天起,bFGF可诱导体外培养人牙髓细胞增殖(P<0.05),bFGF诱导牙髓细胞增殖在第4天即可达到高峰(P<0.01).结论:bFGF可诱导体外培养人牙髓细胞增殖,该诱导作用具有剂量依赖性和时间效应.     

人牙髓细胞体外培养及向成牙本质细胞的诱导分化

目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系。方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成。利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,取第3代牙髓细胞,胰酶消化后进行细胞计数,连续观察7d,绘制生长曲线。第3代牙髓细胞,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化,观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化,用Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力。结果:①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞。②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列。4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性。③与未诱导的细胞相比,矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高,但到第4周后活性有所降低。结论:实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,是研究成牙本质细胞的较好模型。     

牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖

背景：若牙髓干细胞诱导分化后仍然具有与未分化时相似的免疫调节能力,则有可能为组织工程提供同种异体种子细胞来源。目的：观察牙髓干细胞表面免疫分子的表达以及体外调节淋巴细胞反应的功能。方法：从C57BL/6小鼠牙髓组织中分离获取牙髓干细胞,体外培养至第2代,流式细胞仪检测免疫分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达。以1×105/孔牙髓干细胞刺激异体淋巴细胞,观察细胞增殖情况。以1×105/孔数量的牙髓干细胞或经γ-干扰素作用后的牙髓干细胞加入混合双向淋巴细胞反应体系中,观察淋巴细胞增殖情况。结果与结论：牙髓干细胞表达MHC-Ⅰ类分子,但未检测到MHC-Ⅱ类分子阳性表达。γ-干扰素刺激48 h后,MHC-Ⅰ表达未见明显增高,MHC-Ⅱ类分子表达明显增高。异体或经γ-干扰素作用的牙髓干细胞均未能刺激淋巴细胞体外增殖。说明牙髓干细胞可在体外调节淋巴细胞增殖反应,有可能成为组织工程或细胞治疗中同种异体细胞来源。     

干细胞因子促进牙髓干细胞增殖与骨向分化能力

背景:干细胞因子作为对干细胞的增殖分化具有一定促进作用的因子,是否影响牙髓干细胞的生物学特性从而在牙齿再生中发挥重要作用尚不清楚.目的:观察干细胞因子对人牙髓干细胞增殖与骨向分化能力的影响.方法:采用酶消化法培养因正畸需要拔H{的健康人牙的牙髓组织,接种于培养板,加入含1,10 μmol/L干细胞因子的培养液,以正常培养液作为对照.MTT法检测细胞增殖,real-time PCR检测成骨相关基因骨唾液蛋白、骨钙素Mrna的表达,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性.结果与结论:干细胞因子对牙髓干细胞的增殖具有促进作用,干细胞因子上调了骨唾液蛋白、骨钙素Mrna的表达,增强了牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性,且具有随浓度增加促进作用增强的趋势.提示干细胞因子可以促进人牙髓干细胞的增殖及骨向分化能力.     

Multilineage potential of STRO-1+ rat dental pulp cells in vitro

The aim of the current study was to determine whether STRO-1 selection is an effective approach for purifying rat dental pulp stem cells, and especially whether such selection is beneficial on the multilineage differentiation capacity, i.e. whether selection will account for a higher rate of differentiation or lesser variability. In this study, two cell populations (STRO-1(+) and non-sorted cells) were cultured under conditions promoting neurogenic, adipogenic, myogenic and chondrogenic differentiation. Results of light microscopy, histochemistry, and immunohistochemistry showed that STRO-1(+) cells were capable of advancing into all four differentiation pathways under the influence of inductive media. Quantitative PCR and statistical analysis on specific differentiation markers confirmed that there were significant upregulations in STRO-1(+) cells compared to the other populations, during induction culture. On the basis of our results, we concluded that: (a) rat STRO-1(+) dental pulp stem cells are capable of differentiating towards multilineage cell types, including neural cells, adipocytes, myocytes and chondrocytes; (b) the STRO-1(+) population has a more defined multilineage potential compared to non-sorted cells, probably because of its more homogeneous nature. .     

微囊化成年兔许旺细胞的体外培养

背景:研究发现将体外培养扩增的大量许旺细胞种植到神经导管上来引导周围神经再生效果明显,而目前备受关注的微囊化免疫隔离技术,在克服免疫排斥问题上具有明显的优势与实用性.目的:微囊包裹兔许旺细胞并进行体外培养,观察许旺细胞形态及增殖变化.设计、时间及地点:体外细胞水平观察实验,于2005-09/2006-05在南昌大学第二附属医院分子实验室完成.材料:健康成年家兔由南昌大学医学院动物中心提供,微囊发生器由南昌大学医学院神经生物学研究室研制.方法:使双侧坐骨神经发生Wallerian变性,经改良后反复差速贴附法进行培养,快速分离纯化许旺细胞.海藻酸钠-氯化钡一步成囊法包裹生长良好的第3代许旺细胞.主要观察指标:倒置显微镜下观察培养过程中微囊化许旺细胞形态变化,MTT检测不同时期微囊化许旺细胞及游离许旺细胞的增殖改变.结果:在培养过程中可见微囊及其囊内许旺细胞形态均保持完整,微囊未见破损.微囊化后的许旺细胞总体呈现悬浮生长的趋势.培养0,1,3,5,7 d时MTT检测微囊许旺细胞组与游离许旺细胞组吸光度值差异有显著性意义(P＜0.05).结论:微囊包裹的许旺细胞体外可存活较长时间,微囊化许旺细胞相比游离许旺细胞增殖速度有所减慢.     

中药骨碎补对人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞体外增殖的实验研究

目的探讨中药骨碎补对体外培养的人的牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞增殖的影响。方法采用组织块法外培养人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞,取第4、5代培养细胞随机分为实验组和对照组,实验组加不同浓度的骨碎补,对照组只加培养液。通过HE染色观察其对牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞的形态、结构及生长增殖的影响,通过MTT法和考马斯亮蓝法对实验组和对照组的细胞生长情况和总蛋白合成的检测。结果 1在10~1000μg/ml浓度范围内骨碎补对人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞均有促增殖作用(P0.05),尤以100μg/ml浓度最为明显(P0.01);2总蛋白测定结果显示在骨碎补浓度为10μg/ml时,对照组与其总蛋白含量差异无统计学意义(P0.05),实验组细胞总蛋白含量随骨碎补浓度增加高于对照组(P0.05),尤以500μg/ml骨碎补浓度组作用牙髓成纤维细胞最佳;而100μg/ml骨碎补浓度组作用牙龈、牙周膜成纤维细胞最显著。结论骨碎补在有效作用浓度范围内,其促增殖效应和总蛋白含量与骨碎补浓度呈剂量依赖关系,随着浓度的增加促增殖作用增强、总蛋白含量增加,浓度达到最大作用后,随着浓度增加作用反而呈现减弱趋势。     

In vivo evaluation of human dental pulp stem cells differentiated towards multiple lineages

An increasing number of investigations supports that adult stem cells have the potential to differentiate into matured cell types beyond their origin, a property defined as plasticity. Previously, the plasticity of stem cells derived from dental pulp (DPSC) has been confirmed by culturing cells in lineage-specific media in vitro. In the current study, the in vivo differentiation or maturation potential of DPSC was further analysed, by transplanting human DPSC/collagen scaffold constructs into subcutaneous tissue of immunocompromised mice. Cells received odontogenic, adipogenic or myogenic pre-induction, whereas control samples received no stimulation. Also blank collagen scaffolds were implanted. The results indicated that seeded cells produced tissue within the implanted constructs after 3 weeks of implantation. According to morphological and phenotypical changes, the pre-induced DPSC showed the ability to further differentiate along odontogenic, myogenic and adipogenic pathways in vivo. Moreover, DPSC without pre-treatment were able to spontaneously differentiate along odontogenic and adipogenic directions in vivo. However, only limited mature morphological changes were detected in histology. In summary, stem cells derived from human dental pulp form a suitable source for tissue engineering and cell-mediated therapy, although additional analyses should be considered.     

大鼠牙髓干细胞的基本细胞学特征以及增殖和矿化能力分化为牙本质样细胞的可能性

目的实验观察大鼠牙髓干细胞的基本细胞学特征和增殖及矿化特性.方法实验于2003-07/10在军事医学科学院组织工程研究中心实验室完成.采用光学显微镜观察大鼠牙髓干细胞生长变化.①细胞爬片固定后用苏木精-伊红染色观察细胞的基本形态.②采用四甲基偶氮唑盐法对大鼠牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞的生长及增殖能力进行检测比较.③应用矿化液对大鼠牙髓干细胞进行诱导并采用Von Kossa染色的方法检测大鼠牙髓干细胞矿化能力.结果①大鼠牙髓干细胞基本形态特征为成纤维细胞样生长,细胞呈梭形,密集区细胞形态多样,可见多角形或椭圆形细胞密集排列.②细胞生长曲线及群体倍增时间大鼠牙髓干细胞群体倍增时间为58.3 h;骨髓间充质干细胞的生长较牙髓干细胞旺盛,其群体倍增时间为41.8 h.③大鼠牙髓干细胞矿化能力Von Kossa染色可见细胞密集区为黑褐色,呈结节状分布,表明有钙化结节形成.结论大鼠牙髓干细胞形态正常,虽比骨髓间充质干细胞稍弱,但仍具有较强的增殖性能,还有一定的矿化能力,说明在一定条件下可向牙本质样细胞分化.