CYP3A4基因启动子受AFB1调控位点的鉴定

目的 构建不同长度人CYP3A4基因启动子荧光素酶报告质粒并予鉴定,检测L02细胞中各荧光素酶报告质粒相对荧光素酶活性,并分析AFB1处理对其影响,找出AFB1调控人CYP3A4基因可能的启动子区域.方法 采用PCR技术扩增不同长度人CYP3A4基因启动子片段,将其插入荧光素酶报告质粒pGL3-basic中荧光素酶编码序列之前,构建含不同长度CYP3A4启动子的报告质粒pGL3-basic-CYP3A4-1～7,将报告质粒转染L02细胞,检测其荧光素酶活性来表示CYP3A4对应启动子片段的转录活性.检测各报告质粒在AFB1处理下与DMSO对照相比荧光素酶活性上升的比例,找出AFB1上调CYP3A4启动子转录活性的作用区域.结果 报告质粒测序结果证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功.将报告质粒转染L02细胞,AFB1和DMSO处理后检测结果表明pGL3-basic-CYP3A4-1～6和pGL3-basic-CYP3A4-7相对荧光素酶活性受AFB1上升比率差异有统计学意义(P＜0.05),pGL3-basic-CYP3A4-1至pGL3-basic-CYP3A4-6这6个报告质粒相对荧光素酶活性受AFB1上升比率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了人CYP3A4基因不同长度启动子片段的荧光素酶报告质粒,并初步确定AFB1可以通过调控CYP3A4启动子-200～0 nt的结合位点来上调CYP3A4的转录活性.     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

PGC-1α辅助激活人PEPCK基因转录

 【目的】构建人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子荧光素酶报告质粒PGL3-hPCK-luc,并探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)在转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)介导下对人PEPCK基因启动子活性的影响。【方法】从人全血基因组DNA中克隆PEPCK启动子基因片段,并重组进荧光素酶报告载体PGL3-basic,将pcDNA3.1-PGC-1α、pcDNA3.0-HNF4α表达质粒与PGL3-hPCK-luc按不同组合共转染进人肝癌细胞株HepG2细胞或正常人肝细胞株LO2细胞,培养48 h后检测细胞裂解液中荧光素酶活性。【结果】通过酶切鉴定及测序证明扩增的人PEPCK启动子片段成功插入载体质粒中。转染后人PEPCK启动子基因荧光素酶活性较空白对照组增加60倍(P < 0.05);共转染质粒进HepG2细胞或LO2细胞后,HNF4α均可以增强人PEPCK启动子基因荧光素酶活性,在HepG2细胞,荧光素酶活性是对照组的2.69倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是对照组的3.64倍(P < 0.05);PGC-1α可以明显增强HNF4α对人PEPCK启动子的激活作用,在HepG2细胞,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.01倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.82倍(P < 0.05)。而与单一转染组相比,共转染pcDNA3.1-PGC-1α与pcDNA3.0-HNF4α显著增加了PEPCK的mRNA和蛋白表达水平(P < 0.05)。【结论】人PEPCK启动子基因报告质粒成功构建,且转录因子HNF4α可以激活人PEPCK启动子活性,辅助激活因子PGC-1α可以进一步加强HNF4α的作用。     

小鼠Lrp5基因基本启动子分析

目的：研究小鼠Lrp5基因基本启动子。方法：PCR扩增小鼠Lrp5基因基本启动子序列，构建荧光素酶报告基因表达体系，以PRL—TK为内参照质粒，瞬时转染COS-7细胞，48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果：在小鼠Lrp5基因基本启动子区域，构建了三种荧光素酶报告基因表达体系pGL3—16(-16bp- 132bp)、pGL3—54(-54bp- 132bp)和pGL3—103(-103bp- 132bp)。pGL3—103表达载体的相对荧光素酶活性最高；pGL3—54的相对荧光素酶活性是pGL3—103表达载体的80％；而pGL3—16相对荧光素酶表达活性急剧下降，与阴性对照pGL3-basic的活性相近，无启动子活性。结论：-54bp--16bp区域内含有小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列，其中三个SP1保守序列是小鼠Lrp5基因基本启动子所必需的。     

小鼠激素敏感性脂肪酶基因启动子报告质粒的构建*

目的 拟构建激素敏感性脂肪酶（HSL）基因启动子报告质粒。方法 将以C57bl/6小鼠基因组DNA为模板扩增的小鼠HSL基因启动子序列,插入pGL4.10-basic荧光素酶报告质粒多克隆位点区域,再经PCR、限制性酶切和测序分析筛选出目标质粒pGL4.10-basic-HSL,采用荧光素酶活性分析评价质粒的转录活性。结果 启动子插入片段长度正确,序列与数据库一致;目标报告质粒转入293T细胞后,在过氧化物酶体增殖物激活受体γ作用下具有转录活性,与对照组比较,差异有统计学意义（P?<0.05）。结论 成功构建HSL基因启动子报告质粒。     

PEPCK启动子调控的报告基因表达质粒的构建

目的构建磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控的报告基因表达质粒,为评价PEPCK启动子对下游基因的转录调节创造条件.方法从载体质粒pPEPCK-int中截取大小为550 bp的大鼠PEPCK启动子片段,借助过渡载体质粒PBS-PEPCK,将PEPCK启动子片段插入pGL2-Basic-Luc报告质粒.结果通过酶切鉴定及基因测序,证明pGL2-PEPCK-Luc荧光素酶表达质粒构建成功,并能够在体外表达荧光素酶.结论 pGL2-PEPCK-Luc质粒可作为体外研究PEPCK启动子转录调节的新手段.     

人FAT1基因启动子的克隆鉴定及其功能浅析

目的：克隆人脂肪非典型钙黏蛋白1（FAT atypical cadherin 1,FAT1）基因启动子,找到核心启动子区域并对其转录调控机制进行初步分析。方法：通过PCR方法获得人FAT1基因5′上游1 163 bp（-1 029~+134 bp）的片段,亚克隆至pGL3?basic载体;通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测各重组质粒在A549细胞和HEK293T细胞中的活性,找到核心启动子区域。利用生物信息学方法预测核心区域的转录因子结合位点。结果：经测序、酶切鉴定,成功构建了人FAT1启动子荧光素酶活性报告基因重组质粒。与pGL3?basic质粒相比,人FAT1启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）。通过生物信息学软件预测人FAT1启动子区域（-233~-110 bp）可能含有TFAP2C、KLF5等转录因子结合位点。结论：成功构建人FAT1启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性比较,推测人FAT1的核心启动子区域位于-233~+134 bp区域,其中可能含有若干转录因子结合位点。     

Survivin启动子的克隆及其在膀胱癌细胞BIU87中的活性鉴定

目的克隆Survivin启动子的有效片段,并检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的转录活性。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3BSurvivin重组质粒,用脂质体法瞬时转染BIU87及SV-HUC-1中,检测Survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3BCMV重组质粒作为阳性对照。48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体,转染BIU87细胞后的荧光素酶活性为2 286.98±440.21,而SV-HUC-1荧光素酶活性为12.32±1.16,两者差异有统计学意义（〈0.01）。结论本实验成功克隆的Survivin启动子在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,其有可能作为调控元件用于膀胱癌的靶向性基因治疗。     

成纤维细胞生长因子19转录活性及上游结合元件分析

目的 构建FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,并研究分析其启动子区的转录活性和结合元件。方法 设计特异性引物PCR扩增基因组DNA,得到长为3323bp的FGF19基因启动子区片段,将此PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic Vector,获得全长为3323bp的FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒。在此基础上设计特异性引物,构建5''端系列缺失荧光素酶报告基因质粒。通过瞬时转染实验检测所构建质粒的相对荧光素酶活性,分析不同启动子区片段对FGF19基因转录活性的影响,并用软件预测影响启动子转录活性的关键转录因子。结果 构建了7个FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,经双酶切和测序验证均正确。瞬时转染及荧光素酶报告基因分析实验发现启动子区-2351~-2316是调控FGF19启动子转录活性的重要序列,且在线软件预测该序列存在潜在的转录因子位点。结论 FGF19基因启动子区-2351~-2316是调控其启动子转录活性的关键位置。     

人NaDC1基因启动子序列转录调控元件的初步分析

目的 对hNaDC1基因启动子序列转录调控元件进行初步分析.方法 构建hNaDC1基因5'侧翼序列系列缺失质粒,以双荧光素酶报告基因检测系统检测hNaDC1基因5'侧翼区(-2 232/ 136)的转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用.结果 pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性最高,为(2.98±0.45);pGL3-hNaDC1D的转录活性最低,为(0.45±0.14).以pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性为基准(100%),其他4种质粒相应的转录活性分别为:pGL3-hNaDC1B 86.7%,pGL3-hNaDC1C 89.4%,pGL3-hNaDC1D 15.8%,pGL3-hNaDC1E 61.2%.MatInspector 5.0软件预测结果显示hNaDC1基因5'侧翼启动子序列共含有22个14种转录因子结合位点.结论 hNaDC1基因5'侧翼区-1 084/-254和-12/ 136区域可能存在有正性作用转录因子的结合位点.     

大鼠MIP⁃1α基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其IRF⁃8结合元件的初步鉴定

目的：构建大鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK-293T)中过表达干扰素调节因子-8(interferon regulatory factor-8,IRF-8)对MIP-1α基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-8结合元件。方法：采用PCR技术,扩增出大鼠MIP-1α基因启动子序列,将MIP-1α基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建MIP-1α基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-FL)。将上述pGL3-MIP-1α-FL和本课题组已构建的大鼠IRF-8过表达质粒(pIRES2-IRF-8)共转染HEK-293T细胞,检测细胞内荧光素酶活性,确定IRF-8对MIP-1α基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件,并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-1~3)。将上述MIP-1α基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-8过表达质粒共转染HEK-293T细胞,再测定荧光素酶活性,初步确定IRF-8的结合元件。结果：菌液PCR及核酸测序证实,上述pGL3-MIP-1α-FL(-1400 ~ +94nt)质粒构建成功。将pGL3-MIP-1α-FL和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,过表达IRF-8可显著增加MIP-1α基因启动子活性。应用生物信息学软件预测发现MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件(-1157~ -1144nt、-740~ -734nt、-683~ -670nt、-365 ~ -359nt、-249 ~ -236nt),并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3-MIP-1α-1(-453 ~ +94nt)、pGL3-MIP-1α-2(-352 ~ +94nt)和pGL3-MIP-1α-3(-3 ~ +94nt)。将pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1~3和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,pGL3-MIP-1α-3的启动活性显著低于pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1和pGL3-MIP-1α-2。提示,IRF-8可能结合在大鼠MIP-1α基因启动子的-352 ~ -3nt区域的IRF-8结合元件(-249 ~ -236nt)上。结论：本实验成功构建了大鼠MIP-1α基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-8在MIP-1α基因启动子上的可能的结合元件,为后续研究奠定了基础。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的：鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法：分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2 000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果：成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1～500 nt、1～1 000 nt及1～2 000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1～2 000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1～2 000 nt...     

人cGAS 基因启动子的克隆鉴定及功能初探

目的：构建人环鸟苷酸?腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate?adenosine monophosphate synthase,cGAS）基因启动子,确认其活性,进而对转录调控机制进行初步探究。方法：采用 PCR 方法扩增人cGAS 基因 5′上游 1 254 bp（-1 178~+76 bp）的片段,酶切后连接到pGL3?basic 质粒,以该质粒为模板合成不同长度的启动子质粒。通过双荧光素酶报告基因实验验证不同质粒在Hela细胞中的活性,利用生物信息学方法预测启动子区存在的转录因子结合位点。通过点突变实验验证潜在的转录因子结合位点。结果：人cGAS启动子质粒初步构建成功。转染后,cGAS 启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P＜0.05）。人cGAS近端启动子区域（-414~+76 bp）经生物信息学软件分析可能含有 Sp1、CREB、USF1、RAP1、C?JUN、OCT?1等转录因子的结合位点。点突变实验证实Sp1、CREB正向调控该启动子区域。结论：人cGAS近端启动子区域（-414~+76 bp）存在较强的启动子活性,该区域含有多个潜在的转录因子结合位点。转录因子Sp1、CREB调控人cGAS启动子区。     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

survivin启动子有效片段的克隆及其在胃癌细胞AGS中的转录活性研究

目的 克隆survivin启动子的有效片段，并检测它在人胃癌细胞株AGS和人正常胃上皮细胞GES-1中的转录活性，为该启动子在胃癌的靶向性基因治疗中奠定基础。方法 用PCR扩增survivin基因的启动子片段，克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic，构建pGL3-sur-pro重组质粒，用脂质体法瞬时转染AGS及GES-1中，检测survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3-CMV-pro重组质粒作为阳性对照。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增的survivin启动子片段长约440bp，测序结果与GenBank中survivin启动子序列一致。成功构建了pGL3-sur-pro重组质粒。荧光素酶活性检测显示，survivin启动子片段在细胞株AGS中有较高转录活性，而在GES-1中几无转录活性。结论 本实验克隆的survivin启动子有效片段在胃癌细胞株AGS中有转录活性，在正常胃上皮细胞中无活性。其有可能作为调控元件用于胃癌的靶向性基因治疗。     

二甲双胍和LPS通过转录因子RUNX2调控NFATc2基因的转录

目的 构建人T细胞活化核因子C2（NFATc2）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法 利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果 研究成功构建了不同片段长度（2170、2077、1802、1651、1083、323 bp）的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍（1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850）。中浓度（5 mmol/L）和高浓度（10 mmol/L）的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍（1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321）。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍（1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321）。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降（2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786）。结论 pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。     

肺动脉高压患者Ⅱ型骨形成蛋白受体基因启动子-142G>A突变的研究

目的 探讨Ⅱ型骨形成蛋白受体(BMPR2)基因启动子突变与肺动脉高压发病的关系.方法 对1例家族性肺动脉高压(FPAH)、19例特发性肺动脉高压(IPAH)患者和50名健康成人进行BMPR2基因启动子区转录起始点上游-2022 bp的DNA序列测定.分别将突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段插入pGL3-basic双荧光素酶报告基因载体中,获得pGL3-BMPR2启动子-突变型重组质粒和pGL3-BMPR2启动子-野生型重组质粒.以2种重组质粒分别转染人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)和人肺动脉内皮细胞(HPAEC),用Veritas微孔板发光检测仪检测突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段在2种细胞中的转录调控活性(结果以萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性比值表示).应用MAPPER软件分析突变型和野生型BMPR2基因启动子区转录因子结合位点.结果 在1例36岁女性FPAH患者的BMPR2基因启动子区发现杂合子突变-142G>A.突变型BMPR2基因启动子片段在HPASMC和HPAEC中的转录活性(分别为9.58±3.85、59.07±25.54)均明显低于野生型(分别为16.80±3.55、115.58±38.02,均P<0.05),而且缺失转录因子Sp3结合位点.结论 BMPR2基因启动子-142G>A突变可能与FPAH发病有关.     

人釉蛋白基因启动子在成釉细胞中的转录活性研究

目的构建人釉蛋白（Enamelin,ENAM）基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,通过分析不同的启动子片段的活性,确定启动子的功能区域,为进一步研究Enamelin基因的转录调控机制奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Ehamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在成釉细胞中活性不同,-1216～-554与-312～-133区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Enamelin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Enamelin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Enamelin基因转录调控特点奠定基础。     

大鼠Caspase 8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响?同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136~+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用?另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase 8-1~4)?将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-Caspase 8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加?而将pGL3-Caspase 8-FL?pGL3-Caspase 8-1~4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3?提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336~-136 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域?