白细胞介素7剪接变异体蛋白的表达、复性和纯化

目的表达、复性和纯化重组人白细胞介素7剪接变异体蛋白(interleukin-7 splice variants,IL-7splice variants),为下一步功能研究奠定基础。方法在IL-7剪接变异体(IL-7δ4/5以及IL-7δ3/4)cDNA克隆的基础上进行亚克隆,插入细菌表达载体pET-21b中,构建相应的原核表达载体,阳性克隆测序,证实其构建成功,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,对各蛋白表达条件进行优化、复性及纯化,利用Western blot鉴定重组蛋白。结果各表达蛋白与预期相对分子质量(10.3 ku、9.3 ku)相符,纯化后蛋白纯度高达95%以上,并经免疫印迹鉴定证实表达的蛋白为IL-7δ4/5和IL-7δ3/4。结论成功获得高纯度的IL-7剪接变异体复性蛋白。     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

重组人白细胞介素7蛋白的表达、复性和纯化

目的表达、复性和纯化重组人白细胞介素7(recombinant human interleukin-7,rhIL-7)蛋白,为其功能研究打下基础。方法在已经对IL-7基因TA克隆的基础上进行亚克隆,插入pET-21b载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序成功后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,优化rhIL-7蛋白表达条件,并对表达的蛋白进行复性及纯化,利用免疫印迹鉴定重组蛋白。结果表达的蛋白与预期相对分子质量17 400相符,经优化后确定蛋白表达条件为:诱导温度为37℃、IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L、诱导时间为2 h,且rhIL-7的复性效率较好(约50%),纯化后蛋白纯度高达95%以上,并经Western blot证实表达的蛋白为rhIL-7。结论成功获得高纯度的rhIL-7复性蛋白。     

人蔗糖酶蛋白在大肠杆菌的诱导表达与纯化

目的构建人蔗糖酶(h SUC)基因原核表达载体,诱导表达获得融合蛋白。方法采用反转录PCR法扩增得到h SUC基因片段,并将其克隆到表达载体p ET-28a(+)中,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌中表达,采用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果克隆得到1482 bp目的基因,酶切和测序证实h SUC基因片段成功插入到p ET-28a(+)表达载体。表达的融合蛋白质相对分子质量(Mr)为61 240,Western blot结果显示融合蛋白可以与h SUC抗体特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达和纯化h SUC融合蛋白。     

犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用

目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。     

小鼠FcγRⅢ原核表达、纯化及鉴定

目的: 制备纯化重组蛋白mFcγRⅢ,并鉴定其生物学活性.方法: 从克隆载体mRⅢ-T中扩增mFcγRⅢ胞外区,构建原核表达载体pETmRⅢ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot对重组表达蛋白进行鉴定;表达产物通过包涵体纯化后用稀释方法复性;ELISA检测复性蛋白活性.结果: 成功构建了重组表达质粒pETmRⅢ,纯化和复性了重组蛋白mFcγRⅢ;复性的重组蛋白mFcγRⅢ具有较强的体外活性.结论: 原核重组蛋白mFcγRⅢ复性后具有较强的体外结合配体特性,为探索重组蛋白治疗自身免疫病奠定了基础.     

小鼠PD-L1胞外段基因的原核表达及活性分析

目的原核表达小鼠程序性死亡分子1配体胞外段(exPD-L1)蛋白基因并在体外初步验证其生物学活性。方法应用小鼠脾脏细胞总RNA,反转录PCR克隆exPD-L1基因序列,将其克隆到pGEX-4T-1载体中构建原核表达载体pGEX-4T-1-exPD-L1,经酶切和测序鉴定正确后,转化到E.coli BL21(D3)中,经IPTG诱导表达后,对包涵体蛋白进行复性和纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot法检测证明其正确后,采用GST pull-down检测融合蛋白和PD-1的相互作用,鉴定其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-exPD-L1,并在宿主菌中成功表达相对分子质量(Mr)55 000的重组蛋白,包涵体成功复性和纯化后经Western blot法证明其正确表达,同程序性死亡分子1(PD-1)蛋白的GST pull-down结果表明融合蛋白具有生物学活性。结论成功克隆和表达小鼠exPD-L1蛋白,并证明其具有生物学活性。     

人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。     

大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)原核表达、纯化与大鼠多克隆抗体的制备

目的制备大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)第185至328位氨基酸功能蛋白及其特异性大鼠多克隆抗体。方法以基因合成法合成Ec-ZipA第185至328位氨基酸功能蛋白的基因序列,利用DNA重组技术与p ET-30a(+)载体连接构建重组质粒。将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中进行Ec-Zip A原核表达与表达优化。采用亲和层析方法分离纯化Ec-Zip A后,以荧光偏振(FP)实验进行生物学活性鉴定。以重组Ec-Zip A为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法检测抗体滴度和抗原特异性。结果 SDS-PAGE分析和Western blot实验证实大肠杆菌成功表达Ec-Zip A蛋白。FP实验表明纯化的Ec-Zip A具有良好的生物学活性。ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体滴度,效价可达1∶512 000。Western blot实验证实多克隆抗体具有良好的抗原特异性。结论成功进行了Ec-Zip A原核表达、分离纯化并制备了大鼠抗Ec-Zip A多克隆抗体。     

大熊猫秦岭亚种IL-2基因的克隆表达及其生物活性研究

目的: 明确大熊猫四川种群和秦岭种群IL-2在基因水平是否存在差异; 得到具有具有生物活性的秦岭大熊猫IL-2原核表达产物.方法: 采用RT-PCR方法从ConA诱导培养的秦岭大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到IL-2的cDNA片段, 利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-IL-2, 转入BL21(DE3)中, 以IPTG BL21(DE3)表达IL-2融合蛋白.融合蛋白进行SDS-PAGE和Western blot进行鉴定及可溶性分析; 用纯化的融合蛋白免疫家兔, 制备多克隆抗体; 采用淋巴细胞增殖试验测定融合蛋白生物活性.结果: 通过重组表达获得IL-2抗原蛋白, 相对分子质量(Mr)为34 000; 免疫家兔得到特异性的抗IL-2抗体, 该抗体能够检测细胞内源性IL-2蛋白的表达; 融合蛋白具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性, 并且它的这种作用可被本研究制备的多抗所抑制.结论: 成功克隆了秦岭大熊猫IL-2基因, 与四川大熊猫核苷酸同源性为99.4%表达了具有生物活性的融合蛋白.     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用北大核心CSCD

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

人IgE-Fc结构域的基因克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的通过制备小鼠抗人IgE单克隆抗体,为过敏性疾病的研究及诊断打下基础。方法以CRL8033细胞的cDNA为模板扩增人IgE Fcε3-4段基因序列并将其连接到p ET-32a(+)载体中,转化BL21(DE3)大肠杆菌并进行表达。然后将表达所得包涵体进行变复性,把复性所得蛋白进行亲和纯化,通过SDS-PAGE验证纯化效果。最后将纯化的蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,经三次免疫后取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合。用ELISA法筛选出能结合人IgE蛋白的阳性克隆,并应用ELISA、Western blot等手段对杂交瘤所分泌单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功构建p ET-32a(+)-IgE Fcε3-4载体并纯化IgE Fcε3-4蛋白。用该蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功制备了杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体能够特异性结合人IgE蛋白,可用于ELISA、Western blot等手段对人IgE的检测。结论成功获得了可用于特异性检测人IgE蛋白的单克隆抗体,为人IgE的检测及哮喘等过敏性疾病的研究、诊断及治疗奠定了基础。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

人TRAIL分子胞外区的纯化及活性检测

目的：利用大肠杆菌表达hTRAIL41-281蛋白，并纯化复性成生物活性形式。方法：以IPTG诱导表达，使用Ni-NTA层析柱分离纯化蛋白，透析法复性，SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定，DNA断裂实验检测hTRAIL41-281蛋白的凋亡诱导活性。结果：表达的蛋白以包涵体的形式存在，纯化后得到分子量为30.5kD、纯度在90％以上的蛋白，Western blot证实为hTRARIL41-281分子。经复性，DNA断裂实验检测出该蛋白有较好的诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论：成功地利用大肠杆菌表达、Ni—NTA层析柱分离纯化、透析法复性hTRAIL41-281蛋白，并证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。     

EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用

目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关。本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平。结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EG-FL7。并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质。结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究。