豚鼠耳蜗单离外毛细胞外向钾电流的特性

目的：探讨豚鼠耳蜗单离外毛细胞（ＯＨＣ）钾电流（Ｉｋ）的正常值及其特性。方法：应用膜片钳全细胞记录技术及多种辅助方法,测试在不同细胞内、外液和电压刺激条件下的Ｉｋ、钾尾电流（Ｉｋｔａｉｌ）和反转电位。结果：Ｉｋ具有明显的电压依赖性和时间依赖性,在２０ｍｓ内达峰值,平均激活电压约为－３２．７ｍＶ,从激活电压至０电压时Ｉｋ增长最快,在４０ｍＶ时接近饱和。正常条件下Ｉｋ无明显“ｒｕｎ－ｄｏｗｎ现象”。细     

乙酰胆碱对豚鼠外毛细胞的电压依赖性外向整流钾电流的影响

目的 观察乙酰胆碱（ＡＣｈ）对不同长度豚鼠耳蜗外毛细胞（ＯＨＣ）电压依赖性外向整流钾电流的影响，分析 ＡＣｈ对钾电流激活动力学的影响。方法 全细胞膜片钳技术。结果１００μｍｏｌ／Ｌ的ＡＣｈ对短ＯＨＣ电压依赖性外向整流钾电流的影响较大，刺激电压为５０ｍＶ时，最大外向电流的幅度增加了３４．８％。ＡＣｈ对峰电流的影响大于稳态电流，改变了外向整流钾电流的动力学特征。ＡＣｈ将ＯＨＣ的零电流电位向超极化方向移位约５ｍＶ。1００μｍｏｌ／Ｌ的ＡＣｈ使ＯＨＣ电压依赖性外向整流钾电流的激活动力学发生改变，Ｖ（１／２）＝（－５２．３８±３．９８）ｍＶ，较作用前明显超极化，激活的电压敏感性也提高，Ｓ＝（４０±４．１４）ｍＶ（ｎ＝５）。结论ＡＣｈ增加了ＯＨＣ电压依赖性外向整流钾通道的电导，使通道的激活电压向超极化方向移位。ＡＣｈ的作用是使ＯＨＣ超极化。     

水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞外向钾电流和静息电位及膜电容 …

目的 探讨水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞（ＯＨＣ）钾电流、静息电位（ＲＰ）和膜电容（ＭＥＣ）的影响,分析水杨酸钠影响毛细胞功能的细胞电生理机制。方法 应用膜片钳全细胞记录技术,测试０．１和１．０ｍｍｏｌ／Ｌ水杨酸钠用药前后ＯＨＣ的Ｉｋ、ＲＰ和ＭＥＣ变化。结果 水杨酸钠对Ｉｋ的影响具有时效和量效关系,即用药后有Ｉｋ先增加后降低的双相作用,而高浓度水杨酸钠无论是对Ｉｋ的增加作用还是降低作用都比低浓度时明显     

水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞外向钾电流和静息电位及膜电容影响

目的　探讨水杨酸钠对豚鼠单离外毛细胞（ｏｕｔｅｒｈａｉｒｃｅｌｌ,ＯＨＣ） 钾电流（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔ,ＩＫ）、静息电位（ｒｅｓｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ,ＲＰ） 和膜电容（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ,ＭＥＣ） 的影响,分析水杨酸钠影响毛细胞功能的细胞电生理机制。方法　应用膜片钳全细胞记录技术,测试０．１ 和１ ．０ ｍｍｏｌ／Ｌ水杨酸钠用药前后ＯＨＣ的ＩＫ、ＲＰ和ＭＥＣ 变化。结果　水杨酸钠对ＩＫ 的影响具有时效和量效关系,即用药后有ＩＫ 先增加后降低的双相作用,而高浓度水杨酸钠无论是对ＩＫ 的增加作用还是降低作用都比低浓度时明显。ＲＰ平均约为－６０ ｍＶ,ＭＥＣ 平均约为３９ ｐＦ。水杨酸钠有降低ＲＰ和ＭＥＣ的作用,且均存在着量效关系,即高浓度时的作用大于低浓度时。水杨酸钠对ＲＰ和ＭＥＣ影响的时效关系不明显。结论　水杨酸钠具有影响ＯＨＣ两侧膜的Ｋ＋ 电导和细胞内外Ｋ＋ 分布的作用,并通过对ＩＫ、ＲＰ和ＭＥＣ的影响改变ＯＨＣ的兴奋性和机械活动特性,可能是水杨酸影响毛细胞功能的耳蜗机制之一。     

豚鼠耳蜗外毛细胞的钾通道

目的研究外毛细胞钾离子通道的生物物理学和药理学特性.方法用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术,研究豚鼠耳蜗单离外毛细胞底侧膜的钾离子单通道电流.结果记录到两种钾离子单通道电流:(1)大电导型钙激活钾通道,在等渗140mmol/L KC1溶液时电导为161 26pS(内面向外式)或155±27pS(细胞贴附式),反转电位为0mV;浴液为Hanks液而电极内液为140mmo/L KC1液时,电导为133±9pS(细胞贴附式).当膜内面浴于无钙液时通道活动消失.通道呈簇状发放或快速簇状发放方式,其开启和关闭时程直方图均可用三阶指数方程拟合.双氢链霉素能够可逆性地抑制外毛细胞的大电导型钙激活钾通道,表现为电流幅度减少,在链霉素浓度增大以及细胞膜电位偏正时更明显,新霉素的抑制作用更强.(2)～44pS钾通道.结论豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜具有两种钾离子通道,研究了其大电导型钙激活钾通道的生物物理学和药理学特性.     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙的胆碱能调控

目的　观察胆碱能兴奋剂和拮抗剂对豚鼠耳蜗单离外毛细胞 (OHC)内游离钙浓度 ([Ca2 + ]i)的影响 ,探讨OHC内 [Ca2 + ]i的胆碱能调控机制。方法　健康豚鼠 15只处死 ,Hanks液中分离活性单离OHC ,Fluo - 3/AM负载 30min。分 7组进行不同干预 ,包括乙酰胆碱 (ACH ,胆碱能M和N受体兴奋剂 )、毒蕈碱 (M受体兴奋剂 )、阿托品 (M受体拮抗剂 )、庆大霉素 (N受体拮抗剂 )、加Hanks液对照组和不加干预对照组 ;另 1组为dHanks液中加ACh。用激光扫描共聚焦显微镜 (Bio-Rad ,英国 )观察OHC内 [Ca2 + ]i的变化。结果　Hanks液中不加干预试剂、加毒蕈碱、加Hanks液对照和无钙dHanks液中加ACh等 4组 ,[Ca2 + ]i在 2 5～ 30min内升幅 <1.10倍。Hanks液中加ACh组 [Ca2 + ]i最高升幅平均为 3.0 9倍 ;阿托品 +ACh组 [Ca2 + ]i为 2 .92倍 ;庆大霉素 +ACh组[Ca2 + ]i为 1.81倍。结论　豚鼠耳蜗传出神经递质ACh通过兴奋N受体 ,开放OHC的细胞膜钙离子通道 ,使细胞外Ca2 + 内流外毛细胞内 ;[Ca2 + ]i增加需要细胞外液中钙离子存在。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞和Deiters细胞的钾离子电流及其生理功能

目的 研究豚鼠耳蜗单离外毛细胞(OHC)和Deiters细胞的钾离子电流及其特性，观察乙酰胆碱(ACh)和三磷酸腺苷(ATP)对离子电流的影响。方法 运用全细胞膜片钳技术，分别记录单离OHC和Deiters细胞的离子电流。结果 OHC的长度不同，其钾离子电流表达具有差异性，短OHC具有较大外向电流和内向电流。ACh对短OHC钾离子电流的影响较大，其作用是使0HC超极化。ATP介导的0HC内向电流是非选择性的阳离子电流。ATP介导Deiters细胞出现内向离子电流。结论 K^ 电流在OHC的电谐振中非常重要。Deiters细胞能够通过减少K^ 外流、增加K^ 内流来缓冲周围环境中K^ 浓度的变化。ACh和ATP对OHC离子电流的影响在耳蜗机制中起重要作用。     

尼莫地平对豚鼠耳蜗外毛细胞钙电流的影响

为研究尼莫地平对豚鼠耳蜗外毛细胞钙电流的影响，应用全细胞式记录膜片钳技术，观察１８只豚鼠耳蜗分离出的２０个外毛细胞中，用全细胞方式记录到通道电流２０次。结果发现，尼莫地平可部分阻断豚鼠耳蜗外毛细胞电压依赖性钙电流，减轻毛细胞内Ｃａ＾２＋负荷，其阻断作用是可逆的，对电流的抑制率与尼莫地平的浓度有关，其半数抑制浓度为６０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ，对电流的最大抑制率为３４．１６％。推测尼莫地平在治疗梅尼埃病等     

豚鼠耳蜗单离Deiters细胞的钾电流

目的 研究豚鼠耳蜗单离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞的钾电流及其特性。方法 运用膜片钳技术,在全细胞模式下记录正常细胞外液中钾电流,不同Ｋ＾＋浓度的细胞外液对细胞反转电位和外向钾电流的影响,四氨基吡啶（４－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ,４－ＡＰ）和四乙工胺（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ,ＴＥＡ）对钾电流成分的阻滞作用,探讨外向钾流通道的激活和失活动力学。结果 单离Ｄｅｉｔｅｒｓ细胞具有电压依赖的外向整流     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞钙波的观察

目的：观察豚鼠耳蜗单离外毛细胞（outer hair cell,OHC)内游离钙浓度（[Ca^2]i)是否存在波动，即有无钙波。方法：健康豚鼠10只断头处死，在无Ca^2的dHanks液和含Ca^2的Hanks液中酶－机械法分离获得单离活性OHC，钙荧光抗体Fluo-3孵育后，分别加入乙酰胆碱或空白对照，用MRC－1024型激光扫描共聚焦显微镜（Bio-Rad，英国）观察OHC约50min内[Ca^2]i的变化。结果：dHanks液中加ACh组的5个OHC，[Ca^2]i呈明显的规律性的波动，即产生了钙波，钙波的周期约600s;Hanks液中加ACh组的6个OHC的[Ca^2]i均迅速升高，无钙波出现，在dHanks液和Hanks液中不加ACh分别观察了3个OHC，[Ca^2]i呈平坦型，无钙波，结论：ACh能刺激诱发豚鼠耳蜗单离OHC产生钙波。     

链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞离子电流的影响

使用全细胞式记录膜片钳技术，研究链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞离子电流的影响。结果显示：１ｍｍｏｌ／Ｌ链霉素分别使钾电流和钙电流减少；链霉素对电压依赖性钙电流的半数抑制浓度为５６．０８μｍｏｌ／Ｌ，最大抑制率为２１．７％，表明链霉素以浓度依赖性方式，部分不可逆地阻断豚鼠耳蜗外毛细胞电压依赖性钙电流，对钾电流的阻滞作用部分是阻断Ｃａ＾２＋内流的结果。     

豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的同时分离法

目的：探讨豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）和Deiters细胞（DC）同时分离的方法。方法：选健康杂色豚鼠，解剖出耳蜗基底膜，采用酶消化后机械分离。结果：可以同时获得一定数量，活性良好，长短不一的OHC和DC。结论：熟悉耳蜗的解剖特性，保持Corti器的完整及掌握机械吹打的力度是同时获取活性良好的OHC和DC的关键。     

Electromotile responses and frequency tuning of isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea

Isolated outer hair cells (OHC) of the guinea pig cochlea were exposed to external alternating electric fields parallel to the longitudinal axis of the cells. This resulted in oscillations of the cells' length that were measured photoelectrically using a ratiometric light amplifier. At 5 Hz and elongations up to 300 nm, amplitude of the cell length during oscillation was a linear function of the amplitude of the sinusoidal electric field. When increasing the stimulus frequency up to 32kHz, OHC length changes followed the stimulus cycle-by-cycle. Oscillations at frequencies above 32 kHz escaped the experimental approach by their small amplitudes and could not be excluded. The frequency dependence of the motile response measured at 5–12 000 Hz had low-pass filter characteristics in cells of the second, third and fourth turns of the cochlea. However, frequency tuning of the motile response was absent in each OHC and systematic differences between different turns were not observed.     

A threshold decrease for electrically stimulated motor responses of isolated aging outer hair cells from the pigmented guinea pig

When outer hair cells are isolated from guinea pig cochleas and are placed in normal Hank's medium, they exhibit aging as a slow tonic reduction in length and increase in diameter. During this time the lateral subsurface cisternae become progressively vesiculated and the optical density of the border seen under phase-contrast microscopy decreases. A study of 65 outer hair cells was carried out using video imaging of this process. The base of each cell bonded to the Petri dish and the motility of the cuticular plate was recorded in two ways. To quantify the slow contraction of each preparation, the dimensions of the cell were measured from video replay. Displacements of the cuticular plate in response to an alternating electric field in line with the cell axis were also monitored using a video tracking technique. The amplitude of a 1 Hz stimulus required to cause a visually detectable motor response above baseline noise decreased as the cell degraded. Typically, fresh cylindrical cells exhibiting high optical contrast showed relatively small movements for field strengths up to 2 kVm^–1. However, as the cell depolarized, the rigidity initially decreased and the cell could respond to field strengths down to 0.1 kVm 1 before cell death ultimately occurred. Such a threshold phenomenon in the isolated OHC has not been demonstrated directly until now. This result explains the variability of electromotility in aging in vitro preparations from the cochlea.     

豚鼠耳蜗外毛细胞的简化分离

目的:为获得能够满足电生理需要的外毛细胞,探讨简单可靠的分离外毛细胞的方法。方法:暴露听泡后去除耳蜗骨壳,将螺旋韧带连同基底膜和蜗轴一起放入酶液消化,减少显微镜下分离基底膜的操作程序,同时避免去除螺旋韧带时部分基底膜片段的丢失。结果:获得较多的保持良好活性的单离外毛细胞,耳大约80%的细胞能保持活性平均约6h。结论:去除骨壳后的残余耳蜗整体消化并适当提高消化液浓度的分离法,操作简单,可以获得能够满足电生理实验需要的较多的单离的耳蜗外毛细胞,有利于内耳研究工作的开展。     

豚鼠耳蜗外毛细胞的变性机制

目的:探讨外毛细胞维持形态及变性过程发生的可能机制。方法:倒置相差显微镜下,对于急性酶分离所得的外毛细胞进行6 h的连续性观察。结果:半数以上活性良好的单离外毛细胞可保持活性平均约6 h,变性过程中均出现自表皮板至基底部的纵行褶线。含钙和不含钙的细胞维持活性时间相同。静纤毛缺失可以同样维持较长时间的活性。结论:钙离子浓度和静纤毛损伤不是外毛细胞变性的决定性因素,而环细胞表面的某种弹性机制可能是维持形态保持活性的根本原因。     

高钾诱发外毛细胞的运动

分离出的单个外毛细胞在5.36mmol/L钾含量的Hank平衡盐液（HBSS）中，观察30分钟无明显形态改变。高钾环境（125mmol/L)里，外毛细胞会发生沿纵轴方向的收缩运动，钾可引起外毛细胞去极化，通过电压依赖钙通道而升高细胞内的钙含量。用Verapamil阻断钙通道或以无钙的溶液灌注，外毛细胞在高钾环境中依然发生持续性收缩反应。实验表明：钾去极化引起外毛细胞的收缩反应很有可能是电渗性收缩，这种收缩不依赖钙和收缩蛋白。     

Salicylate-induced morphological changes of isolated inner hair cells and outer hair cells from guinea-pig cochlea

Objectives

The aim of this study is to investigate the salicylate-induced morphological changes of cochlear inner hair cells (IHCs) and outer hair cells (OHCs).

Methods

IHCs and OHCs were acutely isolated from the guinea-pig cochlea. Cells were observed under the inverted microscope and 10 mmol/L sodium salicylate solutions or 0.01 mmol/L dexamethasone-plus-salicylate solutions were applied. The cell length or the ratio between the length and width was the indices of the morphological changes in cells.

Results

Isolated IHCs did not demonstrate any significant changes in sodium salicylate solutions in 20 min and in 40 min, whereas OHCs were shortened by the 10 mmol/L sodium salicylate to 83% in 20 min and 75% in 40 min. There were no significant differences between in the dexamethasone-plus-salicylate solutions and in the control solutions after 20 min and 40 min both in IHCs and OHCs.

Conclusions

Although salicylate affected the isolated OHCs from guinea-pig cochlea, IHCs were not changed morphologically by sodium salicylate applications. Dexamethasone inhibited the salicylate-induced morphological changes of OHCs.