乳猪肝细胞的生物学特性观察

目的 从细胞数量和细胞功能上探讨乳猪肝细胞用于生物人工肝的可行性.方法 采用RPMI1640培养液37 ℃培养分离的乳猪肝细胞,观察乳猪肝细胞生长和增殖特征,检测乳猪肝细胞白蛋白合成、尿素合成、氨清除量、细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)和葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronyl transferases,UGT)活性.结果 在7 d的培养过程中,乳猪肝细胞呈典型的多角形,至少可增殖7倍以上,细胞生长曲线无明显潜伏期;乳猪肝细胞白蛋白和尿素合成量分别在130 ng·10-6cells·h-1和150 μmol·10-6cells·h-1以上,氨清除量和UGT活性在第3天较第1天显著下降(P＜0.05),其后基本维持稳定,CYP活性逐渐下降.结论 体外分离培养的乳猪肝细胞具有较强的增殖能力、合成功能和生物转化功能,能够为生物人工肝提供大量高活性的肝细胞.     

猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的初步研究

目的初步了解中国实验乳猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的情况,探索聚砜膜作为生物人工肝中空纤维反应器膜材料的可行性.方法将分离的新生实验小型猪肝细胞接种到聚砜膜和聚苯乙烯界面,进行形态学观察及生物学功能测定,观察培养猪肝细胞的酶漏出量.结果乳猪肝细胞在聚砜膜界面培养呈球型黏附、铺展,形成多细胞聚集体.与聚苯乙烯组相比较,聚砜膜组的尿素合成和蛋白分泌能力更强,氨转化率也明显提高,LDH和AST的漏出量无显著差异.结论聚砜膜是良好的乳猪肝细胞生长的生物界面,可以作为生物人工肝中空纤维反应器的膜材料.     

微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

三明治培养新生实验小型猪肝细胞的功能与形态

目的 探索双层胶原夹心猪肝细胞的方法，观察培养猪肝细胞的功能与形态特征。方法 将两步法分离的新生中国实验小型猪肝细胞接种于胶原被覆的培养板常规培养，24h后，肝细胞上再加一层胶原形成双层胶原夹心（三明治）培养，观察培养猪肝细胞的白蛋白分泌、形态学特征和乳酸脱氢酶（LDH）漏出量。结果 成功将新生实验小型猪肝细胞固定于双层胶原中，形成三明治状。培养1周内，用SDS／PAGE可检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，倒置相差显微镜下观察到典型的形态特征，培养期内LDH漏出量较少。结论 可用双层胶原对新生乳猪肝细胞进行三明治样培养，为肝细胞提供更接近体内的培养环境，有助于维持特殊的肝功能和形态学特征。     

大鼠肝细胞分离、原代培养及生物学特性研究

目的 :探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法、原代培养肝细胞的生物学特性。　方法 :以SD大鼠作肝细胞供者 ,采用胶原酶消化法分离获取肝细胞 ,并进行原代培养 ;以锥虫蓝染色法测细胞活力 ,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化 ,采用Beckman全自动生化分析仪检测各培养体系不同时间培养上清中Albumin、LDH、Urea的含量。　结果 :胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强。LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1周内出现波动性变化 ,第 3天时LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好。　结论 :胶原酶消化法为一较好的肝细胞分离方法 ,分离的肝细胞在培养第 3天功能最佳     

三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究

目的观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定。方法采用改良原位2步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测培养肝细胞的分泌及合成功能,并与单层胶原培养肝细胞比较。结果平均每个鼠肝可获取2×108~3×108个肝细胞,活率在(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,清蛋白分泌功能、尿素合成能力恢复到最佳状态。三明治构型培养的肝细胞清蛋白分泌功能、尿素合成能力在培养的14d内始终维持较高的水平,并形成肝索样结构,伴胆小管网络形成,肝细胞形态维持达28d以上。结论三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能,三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础。     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究

目的研究冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝支持系统(BALSS)中的生存状态.方法用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞;将1×1010猪肝细胞冷冻保存在-196 ℃液氮中;1个月后复温,将等量的冷冻和新鲜猪肝细胞分别培养在BALSS中,比较其形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能.结果冷冻保存的猪肝细胞,复温后其存活率较高;在培养于BALSS时其生化功能、利多卡因转化功能及超微结构与新鲜肝细胞类似.结论用该冻存方法保存的猪肝细胞可试用于BALSS系统.     

三维拟生态培养网片培养猪肝细胞的功能和形态观察

目的通过观察猪肝细胞的功能和形态,探讨一种三维拟生态培养网片用于猪肝细胞培养的可行性。方法两步法分离乳猪肝细胞,接种于培养网片进行培养,观察培养基中各项生化指标、白蛋白以及培养装置进出口氧分压差的变化,分析安定清除率和尿素合成率的变化,观察肝细胞在培养网片中的形态特征。结果以培养时间分组,分为0、2、4、6、8h组,各组培养基中谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素浓度(TBIL)以及培养装置进出口氧分压差的均数无明显差异(P>0.05);以不同时间段分组,分为0-2、2-4、4-6、6-8h组,尿素氮合成率和安定清除率均保持较高水平,组间存在明显差异(P<0.05),随着时间的延长而有所下降;培养结束时可观察到网片中肝细胞生长的典型形态特征。肝细胞在培养网片中的培养密度达到了108/ml以上。结论生长在培养网片中的肝细胞保持了稳定的生化活性、良好的物质转化代谢能力和生物合成能力、典型的细胞生理代谢特点和生长形态学特征,该培养网片实现了肝细胞的高密度和高活性培养。今后可进一步探讨以此培养网片为基础构建一种新的肝细胞培养系统,以及其应用于生物人工肝的研究。     

大鼠肝细胞的原代培养

目的探索肝细胞的分离和原代培养条件.方法两步灌流法分离SD大鼠肝细胞,并将其培养在Hepatozyme-SFM培养基中,用MTT试验和尿素合成功能检测了解培养中的肝细胞的生物学活性.结果分离肝细胞的即时存活率为88%±2%,产量为(39±12)×106/g克肝脏;培养于体外的肝细胞维持形态稳定和尿素合成等功能达1周.结论应用两步灌流法可取得较好的肝细胞分离效果,应用Hepatozyme-SFM培养基能使肝细胞体外维持生物学功能达1周.     

原代肝细胞体外培养用于利福平和异烟肼肝毒性的研究

目的:研究利福平(rifampicin,LFP)和异烟肼(isoniazid,INH)对体外大鼠肝细胞的毒性.方法:以乳酸脱氢酶(LDH)释放量反映肝细胞损伤,以尿素分泌量和大鼠白蛋白合成量反映肝功能.结果与结论:15 mg/mL异烟肼(5 mL)、10 mg/mL利福平(5 mL)以及相同剂量两药合用时LDH释放量分别为对照组的1.3倍、1.5倍和1.6倍,产生的白蛋白量分别为不加药时的25%、28%和28%,尿素产量也有相应下降但程度不如白蛋白显著.说明该剂量的利福平和异烟肼对大鼠肝细胞均有毒性作用,但两药合用并不增加毒性.进一步将此原代肝细胞模型与连续细胞系小鼠成纤维细胞株L929、与文献报道的动物模型比较,探索原代肝细胞模型在肝毒性研究中应用的可行性.     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0.02%胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞,光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态,自动生化仪定期检测培养肝细胞功能,RT-PCR半定量方法检测白蛋白mRNA,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数(2～3)×108cells/整肝,活力和纯度大于95%,生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降,加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平,白蛋白合成在第3～4天达到高峰,培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Percoll分离液纯化以及HepatoZYME-SFM无血清培养基培养,肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

不同浓度的高锶矿泉水对人肝细胞增殖及功能的影响

目的:观察不同浓度的高锶矿泉水对LO2细胞(入肝细胞株)增殖和功能的影响.方法:LO2细胞分为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L锶矿泉水组(SMW)和双蒸水组(DDW),以5× 104/ml的浓度接种于培养板中,24h后,换成条件培养基培养至7d.分别于2d、3d、5d和7d后行MTT法观察细胞的增殖情况.培养5d的细胞分别用比色法测培养基中总胆红素(TB)的含量,和用赖氏法测细胞内谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性.结果:2mg/L SMW细胞增殖、胆红素摄取量和转氨酶活性无显著变化(P＞0.05);4mg/L和6mg/L SMW组细胞提前出现增殖峰,并较长时间地保持旺盛的增殖状态(P＜0.05);细胞摄取胆红素的能力增强(P＜0.05),AST活性无显著变化(P＞0.05),但ALT的活性降低(P＜0.05);8mg/L SMW组细胞增殖速度减慢、摄取胆红素量增多(P＜0.05),但细胞内ALT和AST的活性均降低(P＜0.05).结论:4～6mg/L浓度范围的天然高锶矿泉水对肝细胞的增殖和胆红素代谢有益,能降低转氨酶活性;但超过8mg/L浓度时可对肝细胞造成一定损害.     

大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的 研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件，探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法 采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞，观察在化学限定培养条件下，肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果 肝细胞培养时间进程显示：10mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞^3H—TdR掺入作用，在60和84h出现2个DNA合成峰；2％DMSO抑制^3H-TdR掺入，但在NA共同作用下，肝细胞在132h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示：HPN NA DMSO培养72h时肝细胞为正常二级分裂，168h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论 NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖，所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究，并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。     

高热预处理对大鼠嗜铬细胞瘤株细胞高温损伤的保护作用

目的 探讨高热预处理(HPC)对大鼠嗜铬细胞瘤株(PC12)细胞高温损伤的影响.方法 体外培养PC12细胞,分为四组,每组6株.正常对照组常规(37 ℃)培养;单纯高热预处理组(HPC组)将细胞置于42 ℃培养箱中1 h后常规培养;严重高温损伤组(LH组)将细胞置于46 ℃培养箱中2 h后常规培养2 h;高热预处理 严重高温损伤组(HPC LH组),细胞置于42 ℃培养箱1 h,恢复常规培养18 h,再于46 ℃下作用2 h后常规培养2 h.处理完毕后观察细胞形态学变化,MTT法测定细胞活力,测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量,了解细胞损伤.结果 HPC LH组形态明显优于LH组,MTT值极显著高于LH组(P＜0.01),LDH释放量极显著少于LH组(P＜0.01).结论 高热预处理对PC12细胞高温损伤产生保护作用.     

抗体预处理降低胰岛移植物免疫原性的研究

目的：探索通过体外预处理降低胰岛移植物的免疫原性，仅需小剂量短期应用免疫抑制剂提高胰岛移植的临床应用范围和移植成功率的方法。方法：分离并纯化成人胰岛细胞，用含20％胎牛血清的CMRL1066培养液37℃培养2d作为对照组；抗体组（培养1d后加MHC-Ⅱ单抗和补体培养1d）作为实验组。猪胰腺取自1～3d的新生猪，剪碎后加胶原酶P消化，Ficoll密度梯度分离纯化。洗涤后加RPMI 1640培养液37℃培养2d作为对照组；     

新型中空纤维编织型生物人工肝反应器的初步构建

目的 为体外生物人工肝支持系统构建一种新型中空纤维编织型生物反应器，提高传统中空纤维生物反应器的性能。方法 采用中空纤维编织方法，制作三维立体型生物反应器，对反应器进行物质传输试验后，将分离的新生实验小型猪肝细胞接种于中空纤维支架上，用培养液循环式人工毛细管系统进行培养，检测生物反应器的生物功能，观察培养猪肝细胞的酶漏出量。结果 传输试验显示，中空纤维编织型反应器的半秀快速传输含人白蛋白和酚红的RPMI 1640培养液。加入肝细胞并培养后，SDS／PAGE可从生物反应器内检测出猪肝细胞分泌的白蛋白，生物反应器内的猪肝细胞有效地将氯化铵转换成尿素。反应器实验中，肝细胞仅释放了少量的ALT、LDH。结论 初步研制出一种新的、符合生物人工肝基本要求的实验型生物反应器，该反应器内培养的肝细胞保持较好的细胞活力，具有生物合成与转换功能。     

大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件,探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞,观察在化学限定培养条件下,肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果肝细胞培养时间进程显示:10 mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞3H-TdR掺入作用,在60和84 h出现2个DNA合成峰;2% DMSO抑制3H-TdR掺入,但在NA共同作用下,肝细胞在132 h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示:HPN NA DMSO培养72 h时肝细胞为正常二级分裂,168 h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28 d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖,所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究,并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。     

精原干细胞体外非分化扩增的初步研究

目的探讨精原干细胞体外非分化性扩增的影响因素。方法采用昆明系小白鼠骨髓基质细胞原代培养,待细胞长成单层后经丝裂霉素C处理,作为精原干细胞培养的饲养层,细胞在37℃环境下培养。结果接种后2～4d,精原干细胞数明显增加,细胞单个、成双或成群,非精原干细胞开始出现崩解死亡;接种4～8d,精原干细胞增殖不明显,处于相对静止期;接种10d后,又开始出现明显的分裂增殖,15d已具有精原干细胞特征,继续培养25d,细胞形态未见明显改变,胞质桥仍明显。结论精原干细胞能在37℃环境温度下,在以骨髓基质饲养层上保持良好非分化性扩增。