重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的

背景：碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比。 设计、时间及地点：对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成。 材料：2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导。5周龄Wistar大鼠用于移植实验。牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选。稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况。 主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较。 结果：利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况。从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性。重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达。转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达。转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化。转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P > 0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P < 0.01)。骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录。转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多。 结论：稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想。外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。 目的：验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。 设计、时间及地点：两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。 对象：6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。 方法：扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5 组：①未转染组：仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组：双无L-DMEM +pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组：双无L-DMEM+pcDNA3.1- SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。 主要观察指标：对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。 结果：MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P < 0 01)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。 结论：双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。     

转染碱性成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤

背景：研究证实,小肠黏膜下层不存在免疫原性,不会引起异种移植中常见的排斥反应,是一种比较理想的人工真皮替代物。 目的：通过基因转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞,并复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤。 方法：日本大耳兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,通过pCDNA3.1质粒将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至生长状态良好的骨髓间充质干细胞,并将转染后的细胞接种于制备好的猪小肠黏膜下层上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表型,WesternBlot检测pCDNA-bFGF真核表达载体转染兔骨髓间充质干细胞的结果,并观察组织工程皮肤的结构。 结果与结论：传代后骨髓间充质干细胞生长迅速,呈长梭形,形态良好。细胞的表面抗原CD90、CD44有阳性表达,而CD45为阴性。碱性成纤维细胞生长因子基因转染入兔骨髓基质干细胞并能稳定表达,转染后的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层中生长良好,可体外构建组织工程皮肤。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。 目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。 方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。 结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性☆

背景：脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而,外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。 目的：探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。 结果与结论：重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β1 mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达**

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

碱性成纤维细胞生长因子与猴骨髓间充质干细胞增殖及向神经元前体细胞分化：不同质量浓度对诱导剂隐丹参酮作用有差异吗？**

背景：碱性成纤维细胞生长因子属于活性单腱多肽,是一种有效的促有丝分裂因子。 目的：探讨不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子对猴骨髓间充质干细胞增殖及成神经分化的影响。 方法：密度梯度离心法体外分离培养猴骨髓间充质干细胞,传代后设立4组,对照组及低、中、高质量浓度组分别加入0,3,6,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,观察不同条件下猴骨髓间充质干细胞的增殖情况。取传至第5代骨髓间充质干细胞,用含20 mg/L隐丹参酮的无血清L-DMEM培养基向神经方向诱导分化,免疫组化染色检测诱导后巢蛋白阳性的表达。 结果与结论：与对照组比较,低、中、高质量浓度组骨髓间充质干细胞增殖速度明显加快(P < 0.05),并且与培养液中碱性成纤维细胞生长因子的质量浓度呈正相关。隐丹参酮诱导0.5 h后,低、中质量浓度组猴骨髓间充质干细胞均有一定程度的巢蛋白阳性表达;诱导1.5 h后,巢蛋白阳性表达细胞数达峰值,低质量浓度组巢蛋白表达效果明显好于高质量浓度组(P < 0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子可以促进猴骨髓间充质干细胞的体外增殖,并且在低质量浓度时能够增加隐丹参酮对骨髓间充质干细胞向神经元前体细胞分化的诱导率,在高质量浓度时则产生相反的抑制作用。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景：目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确。 目的：观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化。 方法：抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10-8 mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录-聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定。 结果与结论：经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%。提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞已具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据。     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景：基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞。 目的：探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成。 材料：成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供。含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠。 方法：取兔颈后皮下脂肪,I型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞。取传至第2代细胞,以0.5×106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%~95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周。 主要观察指标：采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况。 结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达。细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快。流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P < 0.05),G1期比例显著下降(P < 0.05)。 结论：质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景：在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚。 目的：课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成。 材料：人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意。健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供。 方法：从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组：pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组。转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染。 主要观察指标：使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况。 结果：转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性。pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P < 0.05或0.01)。 结论：实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。     

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells expressing the bFGF transgene promote axon regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats

Abstract

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Objective: To investigate neurological effects of transplanting bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) transfected with the basic fibroblast growth factor (bFGF) gene in spinal cord-injured rats.

Methods: Ninety-six male adult Sprague-Dawley rats were randomized into four groups: (1) pcDNA3·1-bFGF group; (2) pcDNA3·1 group; (3) BMSCs group; and (4) vehicle control (DMEM) group. After the rat model of acute spinal cord injury (SCI) was established, 1×10⁶ BMSCs or cells transfected with pcDNA3·1-bFGF or pcDNA3·1 were injected into rats of groups 1-3. At days 1, 7, 14, and 21 after injection, the Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) locomotor rating scale was used to evaluate recovery of motor function. Expression changes of bFGF, myelin basic protein (MBP), and NF200 were examined by immunohistochemistry.

Results: The BBB score of DMEM group was significantly lower than those of groups 1-3 (P<0·05), but the score of pcDNA3·1-bFGF group was significantly higher than that of BMSCs group or pcDNA3·1 group at day 14 or 21 after injection (P<0·01). The number of bFGF-positive neurons in rats of pcDNA3·1-bFGF group was significantly higher than those of groups 1-3 at any time point (P<0·05). The optical density values of NF200-positive neurons and MBP-positive MBP axons in rats of pcDNA3·1-bFGF group were significantly higher than those of groups 1-3 at day 7 or 14 after injection (P<0·05).

Conclusions: bFGF gene-modified BMSCs not only effectively promoted axonal outgrowth but also enhanced recovery of neurological function after SCI in rats, and may be a good candidate to evaluate gene therapy of SCI in man.     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H2O2)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H2O2),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达*

背景：基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力。 目的：构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达。 方法：取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组。空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG。 结果与结论：转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05)。证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达。     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的

背景：体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。 目的：构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。 方法：构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。 结果与结论：构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

血管内皮生长因子对珊瑚人工骨材料成骨作用的影响*☆○

背景：人工骨材料在大块骨缺损中常常无法发挥成骨作用，研究表明如果存在血供不足，骨缺损难以愈合。 目的：了解血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）质粒转染细胞对珊瑚人工骨材料成骨作用的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2004-08/2007-06在德国海德堡大学附属骨科医院实验室完成。 材料：应用6~9月龄雌性新西兰白兔24只制备桡骨骨缺损模型，并随机分为4组；自兔的骨髓分离培养骨髓基质干细胞，传代培养扩增；通过EndoFree Plasmid Giga 试剂盒扩增pVEGF165和pCR3.1的质粒。 方法：将pVEGF165或pCR3.1质粒转染骨髓基质干细胞，将含有VEGF基因的质粒和VEGF基因重组的骨髓基质干细胞分别载入珊瑚人工骨材料，然后植入2组模型兔桡骨干中段15 mm的骨缺损内，另外2组植入载空白质粒或空白质粒转染的骨髓基质干细胞的珊瑚人工骨材料。 主要观察指标：实验动物桡骨骨缺损内人工骨材料吸收速度，血管数目以及新形成的骨量。 结果：VEGF重组的骨髓基质干细胞分泌足量VEGF超过1周；血管计数发现VEGF质粒和骨髓基质干细胞能促进血管生成，但体外转染VEGF的细胞疗效更显著；VEGF质粒或其转染的骨髓基质干细胞对珊瑚人工骨材料的吸收具有促进作用。 结论：VEGF基因重组的细胞能够持续表达高于正常水平的VEGF，并且能够在一定程度上促进人工骨材料的吸收。     

小分子干扰RNA介导RhoA沉默优化骨髓间充质干细胞的培养

以往骨髓间充质干细胞的培养方法存在衰老和分化率低等问题。 目的：检测是否可以通过沉默RhoA基因的方法优化骨髓间充质干细胞培养。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组培养：干细胞组(未转染小分子干扰RNA)、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组、经小分子干扰RNA 转染的干细胞组。用RT-PCR,Western blot检测骨髓间充质干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用,采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：与干细胞组、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组比较,经小分子干扰RNA 转染的干细胞组RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多(P < 0.05)。说明通过沉默RhoA基因的方法可以促进骨髓间充质干细胞增殖,优化培养方法。