VEGF对大鼠海马回神经干细胞体外增殖和分化的影响

目的： 观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对大鼠海马回神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法: 自生后第3 d的SD大鼠脑海马区分离NSCs，进行体外培养并传代，分为2组：（1）VEGF组加入150 μg/L VEGF的培养液培养；（2）对照组未加VEGF。培养7 d后，撤除VEGF，分别在第7 d及第11 d通过相差显微镜观察细胞形态，并用免疫荧光方法检测nestin和NF的表达，计算各组免疫染色阳性细胞率。结果: 在VEGF作用下第7 d，VEGF组nestin阳性细胞率为52.19%±7.95%，多于对照组的29.26%±4.12%（P<0.01），NF阳性细胞率为22.33%±4.13%，对照组仅有38.62%±5.31%（P<0.01）；在实验第11 d，VEGF组NF阳性细胞率为43.10%±3.70%，对照组仅30.56%±4.16%，P<0.01。结论: 本实验提示VEGF能促进NSCs的增殖,并抑制其分化。     

髓鞘结合糖蛋白抑制神经干细胞向神经元分化和轴突生长

目的： 观察来源于胚胎大鼠海马神经细胞的特征;观察髓鞘结合糖蛋白(MAG)对神经干细胞的增殖、分化及神经元轴突生长的影响。方法: 从胚胎鼠的海马提取细胞进行体外培养,应用免疫荧光染色法检测神经干细胞(NSCs)标志蛋白nestin和doublecortin的表达。应用BrdU掺入法检测不同剂量的MAG-Fc对NSCs增殖的影响。免疫荧光染色法观察各种亚型神经细胞的比例并比较神经元样细胞的轴突长度。结果: 来自SD大鼠16 d 胚胎海马的细胞明显表现出神经干细胞的特征。神经干细胞分化7 d 后,对照组新生成的β-tubulin Ⅲ阳性细胞的比例为18.17%±2.79%,其轴突长度为(136.27±33.66)μm。MAG-Fc (200 μg/L)处理后,β-tubulin Ⅲ阳性细胞比例和轴突长度分别显著减少为10.05%±3.42% (P<0.01)和(84.87±24.94)μm(P<0.01)。增殖实验表明,不同浓度的MAG-Fc对神经干细胞的BrdU整合比率无明显影响(P>0.05)。结论: MAG-Fc对神经干细胞向神经元样细胞的分化及其轴突的生长均有抑制作用,但对神经干细胞的增殖无明显影响。     

成年小鼠室管膜下区神经干细胞分离及培养方法改良

目的:改良成鼠神经干细胞(NSCs)分离培养方法,优化培养条件,为系统研究成体干细胞增殖与分化特性以及利用成体干细胞进行细胞治疗奠定基础。方法:视交叉前1.5 mm处离段脑组织,分离前脑室管膜下区(SVZ),通过机械性消化与化学性消化相结合的操作方法制备细胞悬液,应用改良无血清培养基悬浮培养NSCs。nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,1%胎牛血清诱导分化后免疫荧光染色鉴定NSCs多向分化潜能。系列稀释实验和5-溴脱氧尿核苷(BrdU)掺入实验比较改良培养与常规培养NSCs自我更新能力和增殖潜能。结果:改良培养条件,NSCs 7～9 d可形成nestin阳性神经球。应用1%FBS诱导后,NSCs分化为形态各异的细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,分化比例分别是(18.6±3.5)%、(73.2±5.2)%和(3.6±0.4)%。系列稀释实验结果显示当细胞接种数量为500、1000和2000个,改良培养NSCs形成次代神经球数量较常规培养对照组明显增多(P<0.05),并且8 h BrdU掺入率也显著增高达(42.4±6.2)%(P<0.05),表明改良培养条件下NSCs自我更新能力和增殖活力良好。结论:本研究建立了一种简便、操作性强、重复性高的成鼠NSCs分离培养方法。     

atRA对新生大鼠纹状体神经干细胞增殖和分化的影响

目的：研究全反式视黄酸（atRA）对体外培养的NSCs分裂增殖和分化的作用及其机制。 方法： 分离培养新生SD大鼠纹状体神经干细胞（NSCs），免疫荧光细胞染色加以鉴定；采用不同组合配方的培养液培养细胞，FCM检测atRA对NSCs细胞周期分布和增殖的影响；利用免疫荧光鉴定和分化细胞的分类计数法，判定atRA对NSCs分化的影响。 结果： 细胞周期分析表明，atRA处理组G0/G1期细胞数量显著增加，PI值小于对照组。atRA处理组与对照组的NSCs，经诱导分化后产生的细胞类型有显著差异，atRA处理组产生的神经元是对照组的2.5倍。 结论： atRA能抑制NSCs细胞增殖，并抵消生长因子对NSCs的促有丝分裂作用，atRA还促进NSCs向神经元方向分化。     

脑皮质微血管内皮细胞刺激神经干细胞增殖并增强向神经元分化的潜能

目的体外观察脑皮质微血管内皮细胞(CMECs)对来自大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响响。方法采用Transwell建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型,通过相差显微镜形态学观察及共培养早期nestin和NF,及后期NF免疫组化检测鉴定,计算各阳性细胞数、总细胞数和阳性细胞率。结果在共培养第7天,共培养组NSCs的nestin阳性率为(64.04±9.40)%,对照组仅(9.41±4.80)%(P<0.01);NF阳性细胞率为(13.72±3.92)%,对照组仅(39.79±5.20)%(P<0.01);撤除CMECs后第4天,共培养组NSCs分化成神经元的比例为(55.42±4.75)%,对照组仅(27.18±2.62)%(P<0.01)。结论本结果提示CMECs能促进NSCs的自我更新,抑制其分化,并有增强其向神经元方向分化的潜能。     

重组人CD40配体对卵巢癌SKOV3细胞生长特性的影响

目的： 观察重组人CD40配体（rhCD40L）对卵巢癌细胞株SKOV3增殖、表面抗原变化、细胞周期、凋亡相关基因及肿瘤坏死因子受体相关因子( TRAFs)的影响。 方法： 在体外将SKOV3细胞与不同浓度的rhCD40L作用72 h后MTT法测定细胞增殖；直接免疫荧光标记流式细胞术测定细胞表面抗原及TRAFs变化，RT-PCR法测定凋亡相关基因c-myc、bcl-2、bcl-xl的表达程度，并用Annexin V和PI双标记测定细胞凋亡水平。 结果： rhCD40L在100 μg/L的低剂量时即可抑制SKOV3细胞增殖（0.65±0.10 vs 0.81±0.05），其作用随着rhCD40L浓度的增加而加强，10 mg/L时抑制率达（0.13±0.12 vs 0.83±0.15，P＜0.01），呈明显的浓度相关性，并使细胞分裂阻滞于G1期；rhCD40L可上调SKOV3细胞CD95的表达（42.4% vs 59.2%, P＜0.05），下调抗凋亡基因bcl-2和bcl-xl的表达，促进其凋亡；SKOV3细胞高表达TRAF2（81.3%±9.2%）、TRAF5（47.2%±7.2%）和TRAF6（44.5%±6.3%），rhCD40L可显着下调TRAF2（50.4%±5.3%，P＜0.05）、TRAF5（7.2%±2.1%，P＜0.01）和TRAF6（5.1%±1.1%，P＜0.01）表达，而上调TRAF3（25.2%±6.2% vs 68.8%±5.3%，P＜0.01）表达，对TRAF1（4.3%±1.2% vs 5.1%±1.4%）和4（7.4%±1.2% vs 8.1%±1.4%）的表达则无作用。 结论： rhCD40L通过下调bcl-2和bcl-xl基因表达，并改变细胞内TRAFs表达，使SKOV3细胞的增殖受阻滞于G1期，并促进其凋亡。     

来源于大鼠脊髓星形胶质细胞的神经干细胞的增殖分化特性

目的:通过研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在A-NSC培养中的作用来观察其增殖特性;通过添加血小板生长因子PDGF-AA作为诱导因子来研究A-NSC分化的特性。方法:将A-NSC分四组:bFGF+EGF添加组,bFGF添加组,EGF添加组和对照组进行培养,通过形态观察和流式细胞仪检测细胞周期。同时添加PDGF-AA诱导A-NSC分化,以自然分化为对照组,通过免疫荧光染色观察比较其各类细胞分化比例的差异。结果:可观察到A-NSC在bFGF添加组和bFGF+EGF添加组有正常的分裂周期,而EGF添加组和对照组的细胞几乎都停滞在G0/G1期,显示其增殖受到阻滞;诱导实验检测到对照组细胞的分化比例分别为神经元(89.0±4.2)%,星形胶质细胞(4.6±3.2)%,少突胶质细胞(7.6%±2.5%),具有很高的神经元分化比例;诱导组细胞的分化比例分别为神经元(80.6±4.1)%,星形胶质细胞(3.0±1.3)%,少突胶质细胞(20.6±1.8)%,诱导组分化成少突胶质细胞的能力有显著提高(P<0.001)。结论:在A-NSC的生长过程中,bFGF对A-NSC的增殖起重要作用,在本实验条件下A-NSC倾向于向神经元分化,同时PDGF-AA能够显著诱导A-NSC分化成少突胶质细胞。     

阿托伐他汀影响自发性高血压大鼠血压的机制探讨

目的：探讨阿托伐他汀控制自发性高血压大鼠（SHR）高血压的机制，研究阿托伐他汀对SHR血浆内皮素-1（ET-1）和主动脉一氧化氮合酶（NOS）的影响，以及对SHR的主动脉平滑肌细胞（ASMC）凋亡和P27蛋白表达的影响。 方法： 选用8周龄SHR 12只，随机分为阿托伐他汀治疗组（ATV组, n=6）和SHR组（n=6），并以同周龄WKY（n=6）作为对照。ATV组给以阿托伐他汀（50 mg·kg-1·d-1）灌胃。10周后观察3组大鼠血压、血清总胆固醇（TC）、总甘油三酯（TG）含量变化，血浆ET-1和主动脉NOS活性的改变，以及TUNEL法检测ASMC凋亡率，测定动脉ASMC P27蛋白表达。 结果： 阿托伐他汀给药10周后，ATV组动脉收缩压显著低于SHR组［（134.17±3.60）mmHg vs （173.33±3.78）mmHg, P<0.01］；ATV组血清TC和TG浓度均显著低于SHR组（P<0.01, P<0.01）。同时，阿托伐他汀显著降低SHR血浆ET-1水平［（130.04±40.07）ng/L vs （196.74±59.69）ng/L，P<0.05］和增加SHR主动脉NOS活性［(0.189±0.040）kU/g protein vs （0.124±0.057）kU/g protein，P<0.01］；ATV组ASMC凋亡率显著高于SHR组（16.94%±3.08% vs 9.01%±2.36%, P<0.01）；ATV组ASMC P27蛋白表达阳性率显著高于WKY大鼠（33.02%±5.01% vs 24.25%±4.41%, P<0.05），而SHR组该指标明显低于WKY大鼠（16.08%±7.09% vs 24.25%±4.41%, P<0.05）。 结论： 阿托伐他汀控制SHR血压增高，其机制可能与降低SHR的血浆ET-1水平和增高主动脉NOS活性，以及增高ASMC凋亡率和P27蛋白表达阳性率有关。     

混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的影响

目的　研究神经干细胞(NSCs)与骨髓基质细胞(BMSCs)混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的 影响。　方法　将BMSCs传代培养2d,10μg LbFGF预诱导过夜,DAPI标记后加入到已贴壁分化2d的NSCs中,神 经元培养基混合培养7d后进行神经元特异性烯醇化酶(Nse)染色。对照组于BMSCs传代2d后,一组加bFGF处理 过夜,另一组不加,神经元培养基培养7d后NSE染色。　结果　实验组中部分BMSCs呈NSE染色强阳性,比例为 (13.38±5.79)%,对照组呈NSE阴性　结论　NSCs与BMSCs混合培养可诱导BMSCs转分化为神经元。     

增殖细胞核抗原反义寡核苷酸对人脐血CD34+细胞分化的影响

目的:研究增殖细胞核抗原反义寡核苷酸（PCNA-ASODN）对脐血造血干/祖细胞体外扩增的调节作用。 方法:采用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离CD34+细胞，使用不同浓度的PCNA-ASODN作用于体外扩增的CD34+细胞，应用流式细胞技术检测各种细胞数量，细胞内PCNA表达及细胞周期。 结果:加入了PCNA-ASODN的两个实验组，其PCNA的表达率为（27.2±3.6）%和(19.0±1.5)%，低于对照组的（53.8±8.3）%（P<0.01）。低浓度组扩增的细胞中CD34+细胞比例为（33.4±3.2）％，显著高于对照组的（25.2±2.6）%（P<0.01），而且CD34+CD38-细胞数量达到（57.8±9.9）倍，也显著高于对照组的（43.5±7.4）倍(P<0.01)。 结论:低浓度的PCNA-ASODN有效抑制CD34+细胞在增殖过程中PCNA表达，减缓扩增过程中的分化作用，提高了早期祖细胞的扩增效率。     

凋亡素诱导HepG2细胞凋亡过程中Mcl-1 mRNA和蛋白水平的变化及意义

目的: 探讨凋亡素诱导肝癌细胞HepG2凋亡过程中Mcl-1 mRNA和蛋白水平的变化及其意义。方法: 经脂质体介导将pCDNA3.0-VP3转入HepG2细胞内,48 h后采用Western blotting检测凋亡素、Mcl-1和细胞色素C,实时定量RT-PCR检测细胞内的Mcl-1 mRNA。结果: VP3基因成功地转入HepG2细胞内并稳定表达凋亡素。与空白对照相比,表达凋亡素的细胞出现Mcl-1 mRNA含量减少(0.09%±0.00% vs 0.41%±0.14%, P<0.05),细胞内Mcl-1水平下降(0.43%±0.01% vs 0.90%±0.04%, P<0.01),线粒体释放细胞色素C增加(0.98%±0.02% vs 0.62%±0.03%, P<0.01)。结论: 凋亡素诱导HepG2细胞凋亡过程中存在细胞内Mcl-1 mRNA和蛋白水平的下降,以及线粒体细胞色素C的释放增加。凋亡素诱导的细胞凋亡可能与其下调细胞内Mcl-1 mRNA与蛋白水平有关。     

血小板活化因子对大鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用

目的：研究血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)对离体培养的大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell, ASMC)增殖的影响。方法： 离体培养大鼠气道平滑肌细胞，细胞分为对照组、PAF组；后者又 分为10-6、10-7、10-8、10-9 mol·L-1 4小组，MTT(四唑盐)比色法检测细胞增殖活力并确定PAF最佳作用浓度；用最佳作用浓度刺激ASMC 12 h、24 h、36 h以流式细胞仪测定细胞周期，免疫细胞化学染色(SABC 法)检测该PAF刺激48 h后细胞核增殖抗原(PCNA)的表达。 结果： PAF在10-6-10-9 mol·L-1范围内均能促进ASMC的增殖(P<0.01)，且10-7 mol·L-1时增殖作用最强；用这一最佳浓度的PAF干预12 h后，G0/1期细胞百分比(68.67%)明显低于对照组(85.57%)(P<0.01)；PCNA免疫细胞化学染色发现10-7mol·L-1的PAF作用48 h后，ASMC的PCNA表达率为(71.05±1.22)%，显著高于对照组(53.27±2.56)% (P<0.05)。结论： PAF能以时间依赖方式促进ASMC的增殖，但该作用并不表现为浓度依赖性。     

骨髓基质细胞对中脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的:观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法:采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法,通过显微镜观察神经干细胞的分化状态;使用免疫组织化学技术,分析神经元在神经干细胞后代中所占的比例。结果:(1)骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元;(2)骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论:骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

组胺和低氧对猪肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS基因表达的影响

目的：观察组胺和低氧对培养的猪肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS mRNA和蛋白质表达的影响。方法： 采用半定量RT-PCR和免疫细胞化学的方法。结果： （1）组胺可使肺动脉内皮细胞eNOS mRNA表达增加，在10-5mol/L作用24 h达高峰，为对照组的178.2%±7.7%(P<0.01)，eNOS蛋白质表达也上调，为对照组的173%±47%（P<0.01），主动脉内皮细胞与肺动脉内皮细胞相似，可在组胺10-6mol/L作用24h达高峰，为对照组的177.4%±14.2%（P<0.01），eNOS蛋白质表达也上调，为对照组的165%±54%（P<0.01）；（2）急性低氧12 h肺动脉内皮细胞eNOS mRNA表达增加，24 h达高峰，为对照组的151.0%±9.1%（P<0.01）；蛋白质表达水平也增高到常氧对照组的216%±44%（P<0.01），而主动脉内皮细胞eNOS mRNA与蛋白质均未受低氧影响。结论： 组胺可使肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS表达增加，但两者反应无明显差异；低氧使肺动脉内皮细胞eNOS表达上调，而对主动脉内皮细胞无明显影响。     

5氟尿嘧啶上调干细胞标记物CD133在结肠癌细胞中的表达

目的: 研究通过5氟尿嘧啶(5-FU)对结肠癌干细胞标记物CD133表达的影响,探讨5-FU对结肠癌干细胞的影响。方法: 用流式细胞仪检测CD133在结肠癌细胞株表面的表达, 磁珠细胞分离的方法分离结肠癌细胞株DLD1中CD133阳性和阴性的细胞群,细胞克隆形成实验检测2群细胞的自我更新能力,新型四唑氮盐方法(MTS)检测2群细胞对5-FU敏感性的差异,qPCR方法检测5-FU处理结肠癌细胞后CD133mRNA水平的变化。结果: 结肠癌细胞株DLD1、HT29、SW480、HCT116、Lovo、RKO细胞表面CD133的表达率分别为30.20%、82.00%、0.34%、91.80%、85.30%、0.28%。DLD1细胞中以CD133为标记有2群明显的细胞,MACS方法分离后阳性细胞群中CD133为87.21%±5.33%, 而阴性细胞群中阴性细胞的比例为84.30%±4.65%;CD133阳性的细胞与未分离及CD133阴性细胞相比,克隆形成能力强(46.33%±4.44% vs 31.00%±2.00%,P<0.05),对5-FU的敏感性下降20%,P<0.01。在DLD1和HT29细胞中,5-FU 1 mg/L上调CD133mRNA水平的表达,从1升为1.684±0.012(P<0.01)、HT29细胞从30.702±0.284升为49.379±0.460(P<0.01)。结论: 与CD133阴性细胞相比CD133阳性细胞克隆形成能力强,对5-FU的敏感性下降;5-FU上调干细胞标记物CD133mRNA水平的表达,CD133阳性的结肠癌干细胞在5-FU的治疗过程中被富集。     

叶酸通过调节p53/p21(waf1/cip1)信号途径促进小鼠神经干细胞增殖和分化

目的:研究叶酸对体外培养小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响及作用机制。方法:采用无血清悬浮培养方法分离培养新生小鼠脑NSCs,通过MTT法检测叶酸对NSCs增殖的影响;撤除生长因子后,用含10%胎牛血清的培养基诱导分化培养6 d后,采用Tuj1(神经元标记物)和GFAP(胶质细胞标记物)免疫荧光双标记法检测叶酸对NSCs分化的影响;并应用流式细胞术、RT-PCR法检测给予叶酸对NSCs细胞周期、p53和p21(waf1/cip1)mRNA水平的影响。结果:与对照组相比,MTT法测定结果显示,叶酸组NSCs增殖能力明显增强;分化后免疫荧光双标法测定显示,叶酸组Tuj1阳性细胞的比率明显增加,且差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪测定结果显示,叶酸组NSCs在G0/G1期细胞数量明显减少(P<0.01),而G2/M期细胞数量明显增多(P<0.01);RT-PCR结果显示,叶酸组NSCs中p53和p21 mRNA表达量明显降低。结论:叶酸能促进NSCs增殖及向神经元分化;叶酸对NSCs增殖和分化的影响与调节NSCs细胞周期及p53/p21(waf1/cip1)信号转导途径相关。     

鼠巨细胞病毒影响神经干细胞分化及分化基因的表达

目的： 研究鼠巨细胞病毒（MCMV）感染对体外培养神经干细胞（NSCs）分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致脑发育异常的机制。方法: 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs,检测细胞分化潜能,用感染复数（MOI）为5、1和0.1 MCMV smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物nestin、GFAP和NSE表达的变化,采用MCMV 早期抗原（EA）示踪感染过程（MOI=1）,实时定量RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Neurog2、Myc及Ccnd1 mRNA水平的动态变化。结果: 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记nestin表达阳性,并可进一步分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,GFAP和NSE表达显著低于正常对照组（P<0.05）,可检测到MCMV EA（早期抗原）的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组（P<0.05）;感染组Neurog2 mRNA水平在分化培养后第1 d明显低于正常对照组（P<0.05),感染组Myc mRNA表达水平在第1-4 d显著低于正常组（P<0.05),感染组Ccnd1 mRNA水平在第0.5-1 d明显低于正常组;感染组和正常组的差异随病毒MOI的增加而更明显。结论: (1)MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;(2)MCMV可下调或干扰NSCs Wnt信号途径分化基因Neurog2、Myc和Ccnd1的表达;(3)MCMV抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;(4)MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV感染致脑发育异常的重要机制之一。