重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备及鉴定

目的:利用基因工程技术制备纯化的重组人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),为进一步制备HNE的相应抗体和建立精液HNE的检测方法奠定基础。方法:利用HNE的特异引物从人外周血粒细胞中获得HNEmRNA,并将其cDNA克隆入质粒pGEX-2T中以获得重组质粒pGEX-2T/HNE。重组质粒经PCR、双酶切和基因测序鉴定后转入感受态大肠埃希菌DH5α中,并用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白GST/HNE。重组融合蛋白经凝血酶裂解后获得重组HNE,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化后获得纯化的重组HNE。结果:成功制备重组表达质粒pGEX-2T/HNE,并转化入大肠埃希菌DH5α中。经IPTG在18℃过夜诱导后成功获得重组融合蛋白GST/HNE的表达。经凝血酶裂解和谷胱甘肽琼脂糖珠纯化后成功获得纯化的重组蛋白HNE。结论:纯化的重组HNE的获得为进一步制备HNE的相应抗体和建立精液HNE的检测方法奠定了基础。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB基因的克隆及原核表达

目的:构建淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的融合表达载体,并在原核系统中表达,获得基因重组蛋白,为进一步研究淋病奈瑟菌外膜蛋白的致病作用和免疫保护性提供基础。方法:根据PorB已知序列设计一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌标准菌株NG 29403基因组DNA中扩增出PorB基因,与原核表达质粒pGEX-4T-1构建重组子pGEX-4T-PorB,并将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞。重组子经酶切、PCR鉴定和核酸序列分析正确后,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了淋病奈瑟菌外膜蛋白1 047 bp的PorB基因,成功构建了重组质粒pGEX-4T-PorB,经SDS-PAGE及Western印迹分析显示重组质粒pGEX-4T-PorB在大肠埃希菌中得到了高效融合表达。结论:成功构建pGEX-4T-PorB原核表达载体,并在原核系统中得到了高效表达。     

人骨形成蛋白-7成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

目的：利用大肠杆菌高效表达人骨形成蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）成熟肽。方法：将编码hBMP-7成熟肽cDNA的基因片段克隆入受控于PRPL启动子的温控型大肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDHB-7m以大肠杆菌DH5a为宿主菌进行温度诱导表达。结果：含重组质粒的工程菌经42℃诱导表达后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显现出一条新蛋白区带，分子量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的20％～25％，以包涵体形式存在，经简单纯化处理，得到纯度高于80％的人骨形成蛋白-7成熟肽。结论：hBMP-7成熟肽在大肠杆菌中得到高效表达，为深入研究其生物学活性和临床应用奠定了基础。     

人arresten基因的克隆表达及其对内皮细胞增殖的影响

目的克隆表达血管生成抑制因子arresten基因，并探讨其生物学活性。方法利用基因重组技术，从含有人arresten基因的克隆载体pGEMArr上切下目的基因片段，亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pRSET中，构建表达载体pRSETAN。将重组质粒pRSETAN转化入宿主菌E.coli BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导表达。菌体经超声波破碎，镍柱亲和层析纯化并复性。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定表达蛋白抑制血管内皮细胞的活性。结果酶切鉴定和测序验证，表达载体构建正确。在表达宿主菌中，arresten基因获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白质的27％；表达产物经亲和层析纯化后，蛋白质纯度达96％。经复性，重组蛋白可显著抑制血管内皮细胞生长因子促脐静脉内皮细胞的增殖作用。结论人arresten基因能在pRSET表达系统中得到高效表达；复性后表达蛋白能有效抑制血管内皮细胞的增殖。     

人成骨蛋白-1成熟肽在大肠杆菌中的克隆、表达和诱骨活性测定

目的：扩增、克隆人成骨蛋白-1(human osteogenie protein-1，hOP-1)成熟肽eDNA基因，并利用大肠杆菌表达hOP-1成熟肽。方法：PCR扩增hOP-1成熟肽cDNA基因，将其克隆入受控于含有PR；PE启动子的温控型人肠杆菌表达载体pDH，构建成的重组质粒pDOPm以大肠杆菌DH5α为宿主菌进行温度诱导表达，表达产物纯化和复性后，以小鼠肌袋模型检测诱骨活性．结果：扩增得到hOP-1成熟肽基因；含重组质粒pDOPm的工程菌经42℃诱导后在SDS-PAGE上出现一条新蛋白条带，分了量约为16ku，表达量占菌体总蛋白的21％，以包涵体形式存在，经纯化和复性处理，得到纯度高于85%、具有良好的异位诱导成骨活性的hOP-1成熟肽。结论：成功克隆出hOP-1成熟肽基因，并在大肠杆菌中得到高效表达，复性后具有诱骨活性。     

洋葱伯克霍尔德氏菌L68邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、表达和纯化

采用自行设计的引物,从洋葱伯克霍尔德氏菌L68中PCR扩增得到phnE（邻苯二酚2,3-双加氧酶）基因,亚克隆到高表达载体pET 32a上,转入表达菌株中.经双向测序,证实构建过程中未出现突变.重组子经IPTG诱导后,可以表达有活性的重组双加氧酶.选择26 ℃进行重组蛋白诱导.薄层扫描显示,表达重组蛋白总量最高可占总蛋白的64.92%.利用金属螯合层析对重组蛋白进行了一步纯化,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白纯度达到95%.     

仿生鲶鱼抗菌肽编码序列的设计及克隆

人工合成的仿生鲶鱼抗菌肽DNA序列，经聚合酶链式反应(PCR)扩增后得到带有不同限制性酶切位点的序列XH1、XH2、XH3．将此基因克隆至载体pGEX-5X-3，成功构建了三串联的重组质粒．测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃IPTG诱导，获得高效表达，SDS—PAGE扫描分析表明，融合蛋白可达细菌全蛋白总量的30％，融合蛋白以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞中．     

沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达

目的 构建含有人沉默调节蛋白6(hSIRT6)基因的重组原核表达载体,获得高效表达hSIRT6蛋白的基因工程菌,以及较高产量的SIRT6蛋白.方法 取205 ng HEK293细胞总RNA逆转录后合成的cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hSIRT6的编码序列,并克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组的质粒pGEX-4T-3/SIRT6;将重组质粒pGEX-4T-3/SIRT6转化感受态细菌BL21( DE3),在含100 mg/L氨苄西林的LB平板37℃培养过夜,以pGEX-4T-3空载体作为对照,在相同条件下转化并异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白.产物经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.结果 PCR产物大小及双酶切鉴定证明所克隆的基因是hSIRT6,DNA测序进一步证实与GeneBank序列完全一致.获得高表达及纯化的SIRT6-GST融合蛋白,该可溶蛋白的相对分子质量为72×103,经Western blot鉴定证实为目的蛋白.结论 成功构建了基因重组体pGEX-4T-3/hSIRT6,并制备出可溶性SIRT6-GST融合蛋白.     

小鼠乳酸脱氢酶C亚基在大肠埃希菌中的表达与鉴定

目的 :构建小鼠特异性乳酸脱氢酶 (LDH)C亚基的原核重组载体并进行表达和鉴定。　方法 :提取小鼠睾丸总RNA ,逆转录合成cDNA ,自行设计引物 ,PCR扩增小鼠LDH C亚基编码序列 ,PCR产物经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ 双酶切后 ,克隆至谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 2T中 ,在E .coliBL2 1中诱导GST融合蛋白的表达。　结果 :在异丙基 β 硫代半乳糖苷 (IPTG)的诱导下 ,重组菌高效表达出一个相对分子质量约为6 0 0 0 0的产物。对重组质粒的序列分析表明 ,插入片段的序列与GenBank登录的编码序列完全一致。　结论 :小鼠LDH C亚基的全长编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX 2T ,并在E .coliBL2 1中获得高表达     

基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造

目的：构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并人核实现细胞水平的基因敲除。方法：在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—SBP-Tat—EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS—Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b—SBP-Tat—NLS-cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌,经异丙基硫代一争I）I半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Westernblot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果：经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论：利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。     

全腔镜胸乳入路右侧甲状腺叶切除加中央区淋巴清扫术

建立操作空间,切开颈白线,显露甲状腺。分离峡部下缘显露气管,并以气管为辨识,靠左侧横断峡部,分离椎状叶同时清扫Ⅵa区LN,分离部分硬固定,增加腺体游离度。显露并脱帽法离断上极血管,沿真假被膜间游离腺体外侧,分离右甲状腺下极血管,显露右喉返神经,显露下甲状旁腺。分离Berry韧带,显露保护喉返神经外上方的上甲状旁腺,完整切除右甲状腺叶。取出标本,展示并保留标本,右下甲状旁腺自体移植。分离气管左侧清扫Ⅵc区左侧界,切开胸腺上部清扫Ⅵc下界,沿右颈总动脉表面清扫Ⅵb区外侧界,沿右喉返神经表面分离清扫Ⅵb区LN。进一步游离喉返神经下段,分离并清扫Ⅵb区喉返神经后方LN,中央区清扫结束展示清扫后右甲状腺区域。缝合颈白线,放置引流。     

81例Klinefelter综合征的临床与细胞遗传学分析

目的：对734例男科病人作细胞遗传学检查,得出Klinefelter综合征的发病率,发现一些少见的体征及Klinefelter综合征不同类型染色体核型。方法：外周血淋巴细胞培养和镜下核型分析．常规的临床查体。结果：发现Klinefelter综合征81例,他们都有睾丸小、无精子、第二性征发育不良的Klinefelter综合征的“经典”体征,也发现个别病例伴有唇腭裂体征．激素水平与睾丸活检与文献资料相符。结论：男性不育症的细胞遗传学检查必不可少,细胞学确诊的Klinefelter综合征是临床结论性诊断依据,可免除病人为生育四处求医治疗和睾丸活检之苦。     

Ultrasound-Guided Establishment of Hip Arthroscopy Portals

We describe ultrasound-guided establishment of hip arthroscopy portals. The surface projections of anatomic structures around the hip joint (including the nerve, vessels, femoral neck, and acetabulum) were marked. The entry points were then planned for the anterolateral and anterior portals and, if necessary, the posterolateral portal. The anterolateral portal was first placed. Through the use of real-time ultrasound guidance, a pin was inserted into the hip joint and 20 mL of normal saline solution was injected. A K-wire was then inserted into the joint space over the needle. The arthroscopic trocar was introduced along the K-wire, and the arthroscope was inserted to confirm the establishment. The anterior portal was then established. The hip joint was flexed slightly. The previous procedure was duplicated to insert the K-wire. The path of the pin was confirmed by viewing from the arthroscope in the anterolateral portal. If necessary, the posterolateral portal was established by the same procedure.     

不同骨质疏松风险评估工具的筛检效果评价

目的通过对7种骨质疏松风险评估工具的对比,评价其社区与临床应用价值,为预防和筛查骨质疏松提供科学依据。方法共纳入299名40周岁以上的中老年人,其中女性均已绝经,应用双能X线骨密度仪测量其骨密度值并诊断是否患有骨质疏松症,计算各个工具得分,比较变量、灵敏度、特异度和曲线下面积(area under the curve,AUC)。结果绝经后妇女的各个工具得分均有统计学意义(P0.05),亚洲人骨质疏松自评工具(osteoporosis self-assessment tool for asian, OSTA)的灵敏度为96.3%,特异度为6.3%,AUC为0.710;骨质疏松风险评估工具(osteoporosis risk assessment instrument, ORAI)的灵敏度为90.1%,特异度为12.7%, AUC为0.661;骨质疏松风险简单评估(simple calculated osteoporosis risk estimation, SCORE)的灵敏度为25.9%,特异度为81.9%, AUC为0.686;骨质疏松危险指数(osteoporosis index of risk, OSIRIS)的灵敏度为90%,特异度为30.8%, AUC为0.734;骨质疏松预筛选风险评估(osteoporosis prescreening risk assessment, OPERA)的灵敏度为38.2%,特异度为84%, AUC为0.658;美国骨质疏松基金会快速诊断法(National Osteoporosis Foundation, NOF)的灵敏度为90.4%,特异度为26.6%, AUC为0.652。仅NOF筛检的中老年男性骨质疏松具有统计学意义(P0.05),NOF的灵敏度为93.5%,特异度为25.8%, AUC为0.697;而男性骨质疏松症风险评估(male osteoporosis risk estimation score, MORES)筛检的灵敏度为74.1%,特异度为29.0%,AUC为0.575,不具有统计学意义(P=0.190)。结论 OSTA的灵敏度最高,且仅有2个变量,使用最为简便,适合筛检大样本人群;OSIRIS灵敏度和特异度均较好,用于临床筛检更为准确;ORAI和NOF灵敏度较高,适合筛检阳性人群;SCORE和OPERA特异度较好,适合筛检阴性人群;NOF可用于筛检中老年男性骨质疏松。     

完全腹腔镜进展期远端胃癌根治术并改良Roux－en－Y吻合

常规5孔法操作,根据D2淋巴结清扫原则进行胃周淋巴结清扫并解剖离断相应血管。直线切割缝合器离断十二指肠,预切除线处离断胃体。标本装入自制标本保护套。距Treitz韧带15 cm处直线切割闭合器离断空肠,将远端小肠与残胃大弯侧行胃空肠侧侧吻合。沿脐旁做弧形绕脐切口约2～3 cm,将标本取出,并提起近端空肠与远端小肠体外完成端侧吻合。术中失血30 ml,手术时间150 min。     

亲属活体单段供肝移植治疗极低体重婴儿胆道闭锁一例

目的 总结亲属活体单段供肝移植治疗极低体重婴儿胆道闭锁的临床经验.方法 受者为出生仅145 d的男婴,身高66 crn,体量3.08 kg,被确诊为胆道闭锁伴肝硬化.供者为患儿母亲,年龄36岁,身高145 cm,体重47 kg.采用改良背驮式原位肝移植术,切取供者Ⅱ段肝组织作为供肝,移植肝体积与受者标准肝体积比值为92.5%,GRWR为5.19%,供肝动脉与受者肝右动脉用供者左侧股外侧浅隐静脉搭桥行端端吻合,受者三支肝静脉经整合后与供肝静脉行端端吻合,供肝胆管与受者空肠行Roux-en-Y吻合.术后监测供、受者生命体征、肝肾功能及出血和凝血状况等,常规抗感染治疗.受者术后采用环孢素A、吗替麦考酚酯及甲泼尼龙的方案预防排斥反应.结果 供肝切取手术历时370 min,术中供者出血150 ml均回输,切取供肝重量为160 g.肝移植手术历时451min,术中受者失血230 ml,输注全血200 ml和红细胞悬液50 m1,无肝期时间为71 min,供肝冷缺血时间为132 min.供者恢复顺利,术后8 d拆线出院.受者术后5 d肝功能基本恢复正常,术后7 d各项化验指标均正常.但术后7和15 d时,受者分别发生肠道吻合口漏各1次,经修补后痊愈.受者于术后35 d出院,出院时体重增加0.3 kg,各方面与同龄婴儿相当.结论 亲属活体单段供肝移植是治疗极低体重患儿终未期肝病的一种可供选择的治疗方法,经充分的术前评估、精细的手术操作及良好的围手术期管理后,手术能取得良好效果.     

腹腔镜肝血管瘤剜除术临床分析

目的 探讨腹腔镜肝血管瘤剜除术的可行性和疗效.方法 回顾性分析2003年11月至2009年10月进行的27例腹腔镜肝血管瘤剜除术病例资料.肝门阻断采用自制的肝门阻断器或进行半肝阻断,使用电刀、超声刀等进行切除.结果 25例成功完成手术,2例因大出血中转开腹手术,中转率为7.4%.无病死病例,无术后并发症.肿瘤大小为(6.34±2.17)cm,手术时间为(105.21±72.76)min,肝门阻断时间为(10.17±12.21)min.术中出血量为(115.5±212.14)ml,术中输红细胞(0.87±1.45)U,术后引流量为(112.60±201.03)ml.术后恢复活动时间(2.0±0.8)d,术后住院时间为(5.5±2.4)d.总住院时间(12.5±5.3)d,总住院费用为(10041.6±8678.7)元.结论 选择合适的病例,掌握肝门阻断技术,腹腔镜肝血管瘤剜除术是安全、可行的.

Abstract：

Objective To evaluate the feasibility and efficacy of laparoscopic treatment of hepatic hemangioma. Methods The clinical data of 27 patients who received laparoscopic treatment of hepatic hemangioma from November 2003 to October 2009 were retrospectively analyzed. The hepatic inflow to the liver or to a hemiliver was temporarily blocked using a Pringle manoeuvre with a self-invented laparoscopic blocker at the porta hepatis or at the pedicle to the relevant hemiliver. The Electriccautery and ultracision were used for liver transaction. Results Laparoscopic treatment of hepatic hemangioma was successfully performed in 25 patients. Conversion to laparotomy was required in two (8%) patients for uncontrollable bleeding. There were no major postoperative complications and no mortality. The mean tumor diameter was (6.34±2. 17) cm. The operating time was ( 105.21 ±72.76)min. The time of hepatic inflow block was (10. 17±12. 21)min. The blood loss was (115. 5±212.14)ml. The volume of blood transfusion was (0. 87 ± 1.45)U. The volume of postoperative drainage was (112.60±201.03)ml. The time taken to return to normal activity was (2. 0±0. 8) days.The length of postoperative hospital stay was (5.5±2.4) days. The length of total hospital stay was (12. 5 ±5.3) days. The total cost was RMB10041.6±8678. 7. Conclusion In selected patients, laparoscopic treatment of hepatic hemangioma was safe and feasible.     

腹腔镜巨大前列腺囊腺瘤切除一例报告并文献复习

目的提高对巨大前列腺囊腺瘤的认识。方法回顾性分析收治的1例巨大前列腺囊腺瘤并成功进行腹腔镜切除的临床资料,结合文献复习进行讨论。结果本例患者成功行腹腔镜完整切除,手术时间125min,出血量60ml,术中双侧精囊输精管完整保留,术后会阴部坠胀不适消失,复查精液常规精子数目及活动度正常。已随诊12个月,肿瘤无复发。结论巨大前列腺囊腺瘤罕见,最终确诊要依靠病理诊断,其最有效的治疗是手术完整切除,而腹腔镜途径可作为完整切除的微创手段。     

前列腺交界性叶状肿瘤一例报告并文献复习

目的 探讨前列腺叶状肿瘤的分型、临床表现、病理特征、治疗方法及预后情况.方法 2006年10月收治前列腺交界性叶状肿瘤患者1例.患者32岁,因渐进性排尿困难2周、尿潴留1 d入院.直肠指诊示前列腺明显增大,质软、囊性感,表面光滑.血清PSA 20.62 ng/ml.B超及MRI显示前列腺右侧叶多囊性肿大结节,前列腺穿刺活检考虑为良性间叶源性肿瘤,分化欠成熟.结果硬膜外麻醉下行前列腺肿瘤剜除术,切除标本约40 g.病理报告为前列腺交界性叶状肿瘤,肿瘤由上皮和间质成分构成,间质细胞明显增生,细胞有异型性,可见核分裂象;上皮细胞增多,无明显异型性;免疫组化染色Vimentin强阳性,PSA和PAP阳性,SMA阴性.术后40 d患者肿瘤复发,遂行前列腺根治切除术.病理报告为前列腺低度恶性叶状肿瘤,未侵及被膜外,前列腺尿道切端可见肿瘤组织;细胞增生活跃.术后1个月行体外盆腔放射治疗.随访6个月患者生存良好,仍在随访中.结论前列腺叶状肿瘤由增生的上皮和间质成分组成,穿刺活检很难穿到增生的上皮成分而不能确诊;复发恶性度增高,前列腺根治性切除术是目前最可靠的治疗方法.     

腹腔镜膀胱癌根治加回肠膀胱术

目的:总结腹腔镜下膀胱癌根治加回肠膀胱术的手术方法及临床疗效。方法:2003年6月～2007年5月共行25例腹腔镜下根治性全膀胱切除、双侧盆腔淋巴结清扫加回肠膀胱术,患者平均年龄68岁,全膀胱切除和盆腔淋巴结清扫均在腹腔镜下完成,标本自下腹部小切口取出后,体外切取末端回肠10～15cm,近端闭合并与双侧输尿管吻合,远端造口于右下腹壁。结果:所有手术均顺利完成,手术时间210～320min,平均270min。术中出血220～1000ml,平均460ml。平均每例清扫淋巴结数10个,淋巴结阳性率16.2%,手术切缘均阴性。术后3～5天肠道功能恢复,1例因粘连性肠梗阻于术后1周再行手术探查松解粘连。术后2～3周拔除单J管,无肠漏及尿漏并发症发生。随访2～30个月,1例死于原发病转移,无腹壁造口狭窄发生,3例术后B超或造影显示单侧轻度肾积水和轻度输尿管扩张。结论:腹腔镜膀胱癌根治术具有创伤小,恢复快等优点,但手术难度较大,手术技术要求较高。回肠膀胱术手术操作相对简单,并发症少,可作为腹腔镜膀胱癌根治术后尿流改道可选方式之一。