猪心肌苹果酸脱氢酶的制备及应用

设计并优化了从猪心中提取高纯度苹果酸脱氢酶的技术路线,采用组织破碎、二度硫酸铵盐析、DEAE Sepharose F.F.离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 F.F.疏水层析及Sephadex G-75 Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化,苹果酸脱氢酶比酶活达1 212.97 U/mg,纯化倍数达122.64倍,酶活力收率为53.64%.Sephadex G-75 Fine凝胶过滤和SDS-PAGE电泳结果显示纯化的苹果酸脱氢酶相对分子质量约为 69 000 ,含有2个亚基,每个亚基的相对分子质量约为 34 000 .以制备的苹果酸脱氢酶和谷草转氨酶配成双酶反应体系,对葡萄酒中L-苹果酸的含量进行了测定;通过标准样品和葡萄酒样品精密度及回收率(93.2%～104%)实验.     

高纯度诊断用乳酸脱氢酶的制备和酶促反应

设计并优化了植物乳杆茵发酵制备高纯度诊断用乳酸脱氢酶的技术路线．从培育的厌氧型植物乳杆茵中粗提乳酸脱氢酶制备液，经过DEAE Sepharose F．F．离子交换层析、Phenyl Sepharose6 F．F．疏水层析及Sephadex G-25 Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化，比酶活达1096．8U／mg，纯度达88％，纯化倍数达到21．4倍，酶活力回收率为53．9％；高效液相色谱和SDS-PAGE电泳结果显示制得乳酸脱氢酶相对分子质量约为80000，含有两个亚基，每个亚基分子量约为39000．     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶的分离纯化及性质

在有氧条件下,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Blue Sepharose CL 6B亲和层析提纯克雷伯杆菌胞内甘油脱氢酶.酶的纯化倍数和回收率分别为 32.61 倍和 5.83%.通过SDS PAGE电泳测得该酶亚基的相对分子质量约为 34 000.该酶最适表观反应温度和最适反应pH值分别为60 ℃和11.在30 ℃以下及pH值10~12时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH值11条件下,该酶以甘油和NAD 为底物的米氏常数Km分别为 0.75 mmol/L和 0.12 mmol/L.甘油脱氢酶对甘油的生理反应活性最大,对其它醇类如 1,2 丙二醇、乙二醇也有氧化能力.NH4 和Na 对酶有显著激活作用.巯基保护剂可明显地提高酶的活力.     

嗜热厌氧乙醇杆菌组氨酸融合双活性乙醇脱氢酶的克隆、表达和酶学性质

乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶是嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus乙醇代谢途径中的关键酶。根据高同源性的NADP(H)依赖型Ⅱ型乙醇脱氢酶(S-ADH)的序列设计引物,从T.ethanolicusJW200基因组中PCR扩增出编码S-ADH的基因,插入带组氨酸标签的pET-20(b),测序获得基因大小为1 059 bp,并在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。表达产物经Ni亲和柱提纯达电泳纯。带组氨酸标签的重组NADP(H)依赖型乙醇脱氢酶具乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶双活性,能将乙酰辅酶A转化成乙醇.带组氨酸标签的重组酶酶学性质为乙醛脱氢酶活性最适值为pH 8.4,最适温度70℃;乙醇脱氢酶活性正、逆反应分别最适pH 8.0,最适T 55℃;最适pH8.9,最适为T 60℃。以乙酰辅酶A(Aceyl-CoA)为底物,该酶的Km为3.32 mmol/L,Vmax为12.5μmol/(min.mg)。T.ethanolicusJW200中双活性S-ADH的首次发现,建立了该菌乙醇代谢途径中从乙酰辅酶A到的乙醇的另一条通路。     

麦芽根中核酸酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵沉淀及色谱分离技术对麦芽根中核酸酶进行了分离纯化,通过Sephacryl S-200,DEAE Sephadex A-50 and Sephacryl S-2003步色谱分离,得到了部分纯化的两种核酸酶(Ⅰ和Ⅱ),核酸酶Ⅰ的纯化倍数为94,核酸酶Ⅱ的纯化倍数为1790.高效液相色谱显示两种酶作用于酵母RNA的产物均为5′-核苷酸.核酸酶Ⅰ的热稳定性比核酸酶Ⅱ好,在55℃下保温2h后,核酸酶I的活力损失仅13%,而核酸酶Ⅱ则高达64%.两种酶的最适温度分别为55℃和65℃.两种酶的pH稳定性相似,在pH2.5～9.0范围内很稳定.核酸酶Ⅰ的最适pH值为5.0和8.0～8.5,核酸酶Ⅱ的最适pH范围为4.0～5.5.     

曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶的分离纯化和性质

使用75%乙醇沉淀、CM SepharoseFF离子交换色谱、SephacrylS 200凝胶过滤色谱和PhenylSepharoseCL 4B疏水色谱分离纯化技术,对曲霉CJ22 326发酵液中的内切壳聚糖酶进行分离纯化和性质研究.结果表明,纯化后的内切壳聚糖酶ChiB经SDS PAGE凝胶电泳鉴定为单带,其相对分子质量为27700.采用SephacrylS 200凝胶过滤色谱测定的相对分子质量为27800.ChiB作用最适温度为65℃,最适pH值为6.0,75℃保温1h还残留40%酶活.1mmol/LMn2+对ChiB有强烈激活作用,2mmol/LCu2+,Ag+,Hg2+,Cd2+,Fe3+有强烈抑制作用.ChiB作用的最适底物为脱乙酰度95%的胶体壳聚糖.     

Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)LFS 8611合成的β D 半乳糖苷酶具有较高的催化半乳糖基转移反应活力.脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LFS 8611细胞生长和β D 半乳糖苷酶的合成同步.该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之;最适氮源为蛋白胨F403;最适培养条件为:发酵培养基的初始pH值为7.0,摇床的转速为200r/min.培养基中碳源和氮源质量浓度对菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力有重要影响,以12mg/mL乳糖为碳源,16mg/mL蛋白胨(F403)为氮源,在最适培养条件下培养32h后,菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力分别为7.56g/L和18.83U/mL.     

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 纯化,得到纯化152.54 倍胆红素氧化酶,得率19.14%;用PAGE 检测为单一条带,活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶, SDS-PAGE 证明该酶的相对分子质量为64 000.该酶最适反应温度为55 ℃,以胆红素为底物时最适pH值为7.5,而以ABTS为底物时最适pH值为4,该酶在pH 3～8之间都能够检测到酶活.以胆红素为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为552.06 μmol/L和38.91 μmol/(L·min);而以ABTSA为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为631.84 μmol/L和12.79 μmol/(L·min).     

人骨肉瘤组织热休克蛋白gp96-肽复合物的提取、纯化与鉴定

目的 从人骨肉瘤组织中提取、纯化热休克蛋白(HSP)gp96-肽复合物的方法.方法 采用三步蛋白纯化法从15例人骨肉瘤患者肿瘤组织中提取、纯化HSPgp96-肽复合物.SDS-PAGE、Western blot鉴定HSPgp96-肽复合物,应用改良的Bradford计算蛋白得率.结果 应用该方法提取的蛋白质经SDS-PAGE和Western blot特异性鉴定,证实是HSPgp96-肽复合物;蛋白得率为每g湿重骨肉瘤组织可纯化HSPgp96-肽复合物30～40μg/g.结论 三步蛋白纯化法不仅操作简便、重复性高,而且提取的HSPgp96-肽复合物具有高获率、高纯度、高特异性等特点.     

顶青霉木聚糖酶的纯化与性质

从顶青霉(Pencillium corylophilum)P-3-31培养液中分离到3种木聚糖酶组分，分别称为PartA、PartB和PartC.PartB进一步纯化，经SDS-PAGE鉴定为单带，相对分子质量为24200；PartC进一步纯化，经SDS-PAGE鉴定也是单带，相对分子质量为48300.PartA和PartB的最适反应条件为pH4.0,45℃;PartC的最适反应条件为pH5.5,55℃.PartA和PartB对木聚糖以外的底物不能水解；PartC具有水解CMC的交叉活性和β-木糖苷酶活性，但不能将木二糖水解成木糖.3个纯化酶组分和粗酶对不同来源的木聚糖底物均表现出不同的活性.对于粗酶，若桦木木聚糖为底物的相对酶活为100%，则玉米芯木聚糖为底物的相对酶活为143%，蔗渣木聚糖为底物的相对酶活为124%.