草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

草菇(Volvariellavolvacea)在20L发酵罐中以稻草粉为基质进行培养,所产生的β 木糖苷酶(β 1,4 xylosidase,EC3.2.1.37)经硫酸铵沉淀、苯基 琼脂糖(Phenyl agarose)疏水性柱层析、DEAE Sephacel阴离子柱层析、TOSOHASS HW 5S分子筛过滤分离等提纯步骤,达到了电泳纯,提纯倍数为241倍,收率为14.5%.该酶反应的最适pH值为6.41～6.76,最适温度为55℃;在pH值5.78～7.68之间酶活力相对稳定,52℃的半衰期(t1/2)为1h.由凝胶过滤和SDS PAGE测得酶由4个亚基组成,酶的相对分子质量为2825000.在所测定的底物中,β 木糖苷酶仅对对硝基苯基 β D 木糖苷有专一性水解作用,其对对硝基苯基 β D 木糖苷水解的动力学参数Km值为2.4mmol/L,vmax为42μmol/(min·mg).该酶催化对硝基苯基 β 木糖苷水解将产物β 木糖反转成α 木糖.     

黑曲霉496-1菌株植酸酶的分离纯化及酶学性质

黑曲霉(A.niger)496 1菌株所产胞外植酸酶,经透析浓缩、DEAE cellulose离子交换层析及SephadexG 75,Sephacryl100凝胶过滤,获得了2个植酸酶,其相对分子质量分别为64200及41100.该2个植酸酶的最适pH分别为6.0和3.0,最适温度分别为55℃和40℃.初步确定一个是中性植酸酶,另一个为酸性植酸酶.     

曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶的分离纯化和性质

使用75%乙醇沉淀、CM SepharoseFF离子交换色谱、SephacrylS 200凝胶过滤色谱和PhenylSepharoseCL 4B疏水色谱分离纯化技术,对曲霉CJ22 326发酵液中的内切壳聚糖酶进行分离纯化和性质研究.结果表明,纯化后的内切壳聚糖酶ChiB经SDS PAGE凝胶电泳鉴定为单带,其相对分子质量为27700.采用SephacrylS 200凝胶过滤色谱测定的相对分子质量为27800.ChiB作用最适温度为65℃,最适pH值为6.0,75℃保温1h还残留40%酶活.1mmol/LMn2+对ChiB有强烈激活作用,2mmol/LCu2+,Ag+,Hg2+,Cd2+,Fe3+有强烈抑制作用.ChiB作用的最适底物为脱乙酰度95%的胶体壳聚糖.     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticilliummobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥,制得粗酶粉的酶活约为1033U/g.对粗酶研究发现,该酶的最适反应温度为52℃,最适pH为6.0;粗酶的pH稳定范围在4～8,温度稳定范围在20～40℃,离子强度对该酶的活性稍有影响.粗酶经CM 纤维素层析和SephadexG 75凝胶过滤层析后得到较纯的酶,通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度,得到较弱的单一区带.其中,CM 纤维素层析的纯化倍数为4.5,收率质量分数约为78.8%;凝胶过滤层析纯化倍数为1.11,收率质量分数为50%;用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092.     

草菇木聚糖酶的纯化提取和酶学性质

草菇产胞外木聚糖酶通过各级浓缩和纯化,获得接近电泳纯蛋白.通过SDS PAGE测得相对分子质量为24500.木聚糖酶为糖基化修饰的蛋白,含有质量分数20.24%的糖.O 糖基化能增加木聚糖酶的活性,O 和N 糖基化都能提高木聚糖酶的稳定性.5min反应,草菇木聚糖酶在60℃和pH值5.65时活性最高.在此条件下,该酶的Km值为3.87mg/mL,Vmax为1250IU/mg.纯酶的稳定pH值为6.54,57℃时半衰期为1h.     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性

纯化的黑曲霉Aspergillus niger WM20-11所产的酸性β-甘露聚糖酶经Sephadex G-100凝胶过滤层析和SDS-PAGE分别测得相对分子质量为39 000和40 000;IEF-PAGE测得酶的等电点为4.0;最适作用pH值和温度分别为3.5和70℃;糖质量分数19.6%;Mg2 、Ca2 、Li 、Na 、K 对酶有激活作用,Pb2 、Co2 、Fe3 、Mn2 、Hg2 对酶有抑制作用;酶对角豆胶的Km和Vmax分别为66.7 g/L和333μmol/(min.mg);酶蛋白的氨基酸组成中Asp和Glu含量最高;HPLC分析角豆胶酶水解液的主要产物是低聚糖。     

具有β-半乳糖苷酶转苷能力的菌株筛选及鉴定

以乳糖为惟一碳源,5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)为显色剂,从土壤中筛选出10株产β- 半乳糖苷酶较高、生长较好的菌株.在30 ℃下发酵产酶,测定邻硝基苯- β- D-半乳糖苷(ONPG)水解能力.在50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中,加入400 g/L乳糖和200 g/L果糖,并分别添加10株菌所产β- 半乳糖苷酶, 至酶活为400 U/L,37 ℃下反应8 h,经高效液相色谱分析,编号为2-1样品中含有乳果糖.通过形态特征和16S rDNA 序列分析,鉴定菌株2-1为节杆菌属.     

黑曲霉β-D甘露聚糖酶酶学性质及化学组成

在纯化研究的基础上对土壤中筛选诱变得到的黑曲霉菌株所产的β－Ｄ甘露聚糖酶进行了部分酶学性质的研究。该酶的最适温度为５５℃，最适ｐＨ为５．５，酸碱稳定区域为４．５～８．０，以魔芋精粉和瓜儿豆胶为底物分别测得该酶米氏常数为１４．２ｇ／Ｌ，１０．２ｇ／Ｌ，发现Ａｇ＋、Ｐｂ２＋离子对该酶有较强的抑制作用，Ｃａ２＋离子有一定的激活作用。纯化酶的氨基酸组成分析表明，天门冬氨酸和谷氨酸（包括酰胺）含量为２６．９％．利用纸层析初步了解了不同条件下粗酶对魔芋精粉底物的水解产物情况。     

产β-葡聚糖酶淀粉液化芽孢杆菌的选育

通过对一株淀粉液化芽孢杆菌进行紫外和^60Co逐级诱变，使该菌株产β-葡聚糖酶酶活从80U／mL提高到105U／mL；对突变株进行多次单菌落分离及传代，对其传代稳定性的研究表明：该菌株产酶性能稳定；在5L发酵罐中突变株的产酶水平比摇瓶要高，可达120U／mL，产酶周期比摇瓶缩短了15h．     

Clostridium paraputrificum M-21β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的表达、纯化与性质

以ClostridiumparaputrificumM21染色体DNA为模板,经PCR扩增获得编码β N 乙酰氨基葡萄糖苷酶的基因nag3A,与质粒pQE30T所构建的表达质粒pNAG3A在EscherichiacoliM15中表达良好.从重组E.coliM15中纯化得到的Nag3A以4 MU GlcNAc为底物时,最适作用温度和最适作用pH分别为50℃和7.0;在30℃以下和pH6～9之间该酶活性稳定.对4 MU GlcNAc的Km和Vmax分别为7.9μmol和21.8μmol/(min·mg).Nag3A可以水解几丁寡糖和几丁质,作用方式是从非还原端逐一水解β 1,4 D N 乙酰氨基葡萄糖苷键,产生N 乙酰氨基葡萄糖,对几丁二糖具有较高的水解活性.     

中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶

应用AKTA explorer 100型中压液相色谱快速纯化工艺，系统分离纯化了脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）β-D-半乳糖苷酶。K．fragilis发酵生产的菌体细胞经过破碎、离心后的上清液中含有K．fragilis β-D-半乳糖苷酶。粗酶经过AKTA explorer 100中压液相色谱的Hiprep^R 16／10 Source 30Q强阴离子交换柱和Hioad26／60 Superdex凝胶过滤色谱连续两步纯化，酶的回收率为27％，纯化倍数为42。纯化的K．fragilis β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，呈现一条染色谱带，表明纯化的酶具有较高的纯度。K．fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60 000。     

嗜热芽孢杆菌2004产β-甘露聚糖酶产酶条件优化和酶学性质

对芽孢杆菌2004 β-甘露聚糖酶进行了产酶条件优化、初步纯化及其酶学性质的研究.条件优化结果:1.5 g/dL槐豆胶,2 g/dL蛋白胨,培养温度为40 ℃,250 mL三角瓶装液量为70 mL,其他因素影响不大.此最佳产酶条件下,嗜热芽孢杆菌2004 12 h的产酶水平平均为41.92 U/mL,比原来提高了30倍.培养液离心得到上清液,经硫酸铵沉淀,Sephadex G-200分子凝胶过滤和DEAE纤维素离子交换,酶比活达到722 U/mg,纯化了23.94倍,收率为35.1 %.该酶的最适反应温度为70～80 ℃;反应的最适pH值为5.8～6.0;pH值稳定范围为4.0～9.0.金属离子Mg2 和K 对酶略有激活作用.适当浓度的Mg2 不仅对酶有激活作用,还对酶的热失活具有保护作用.     

麦芽中β-淀粉酶的纯化及其性质

采用疏水色谱（ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ）和凝胶过滤色谱（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００）将麦芽中的α－淀粉酶和β－淀粉酶分离，用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）测定酶水解蜡状玉米淀粉的产物，从而验证所得β－淀粉酶样品的纯度。还研究了麦芽中β－淀粉酶的最适反应温度。     

节杆菌10137产β-呋喃果糖苷酶条件及酶学性质

研究表明,节杆菌10137产β 呋喃果糖苷酶的最佳条件为:温度为30℃,pH值7 5,接种体积分数为2%,装液体积为40mL.该条件下β 呋喃果糖苷酶的转移酶活为177.78U/mL,酶作用最适pH值为6.5,最适温度为30℃,在pH值为6.0～8.0和45℃以下稳定.Ag+和Cu2+对该酶有较强烈的抑制作用,EDTA和Mg2+对酶活也有一定影响.     

猪心苹果酸脱氢酶的分离纯化及性质

采用组织破碎,二度硫酸铵盐析,DEAE Sepharose F.F.离子交换层析及Sephadex G-75 Fine凝胶过滤等纯化方法,从猪心中提取得到了苹果酸脱氢酶.提取纯化的苹果酸脱氢酶经SDS-PAGE测定显示为单一条带,相对分子质量为34000.酶活回收率为57.99%,最适pH为8.0,最适温度为50℃.     

碱性脂肪酶同工酶的分离纯化

对经疏水层析 (PhenylSepharoseCL 4L)和阴离子交换层析 (DEAE FastFlow)等部分纯化的样品 ,采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步将其分离纯化 ,获得了PG3 7碱性脂肪酶的 3种同工酶LipaseⅠ、LipaseⅡ和LipaseⅢ .用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和SephadexG 1 50凝胶色谱法分别测得同工酶的相对分子质量为 2 750 0和 2 90 0 0 .测定了LipaseⅠ的等电点为 5.4 ,动力学常数Km 和Vmax分别为 4 .54g/dL和 5.56μmol/ (min·μg) .     

β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的实验研究

目的观察β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷对膀胱癌EJ细胞生长及凋亡的影响,探讨β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药系统用于膀胱癌治疗的应用前景。方法用不同浓度的苦杏仁苷与β-葡萄糖苷酶共同作用于膀胱癌EJ细胞株,用MTT法检测细胞的增殖活性,倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率与凋亡周期。结果与单纯用苦杏仁苷作用相比,加入β-葡萄糖苷酶后膀胱癌EJ细胞的增殖明显受限,增值抑制率可以达到前者的8.19倍;倒置显微镜和透射电镜观察到肿瘤细胞呈现凋亡的表现,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率增加、多数肿瘤细胞阻滞于S期,这些改变随着苦杏仁苷浓度的增加而明显增强。结论β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷后能够明显抑制EJ细胞的增长,其作用机制可能与将肿瘤细胞阻滞于S期而诱导其凋亡有关;β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药系统可能成为治疗膀胱癌的有效策略。     

(1→3)-β-D-葡聚糖构象的理论分析

利用分子力学 (MM 2 )方法计算了 (1→ 3) β D 葡聚糖二糖结构单元全局最低能量构象 ,在此基础上搭建相对分子质量分别为 2 .0 5× 10 4 和 1.0 2 6× 10 5的 (1→ 3) β D 葡聚糖片段并进行分子几何全优化 .结果表明 ,(1→ 3) β D 葡聚糖的能量最低构象为单螺旋结构并且亲水性基团 (多羟基 )位于螺旋体的表面 ,从而认为这种构象可能是其具有刺激免疫和抗肿瘤活性的分子基础 .     

突变黑曲霉高产β-葡萄糖苷酶的培养基优化

对实验室筛选出产β- 葡萄糖苷酶的黑曲霉进行辐射诱变处理得到高产酶突变菌株,同时采用单因素和正交实验对黑曲霉产酶培养基进行优化研究.结果表明:经过X射线辐射诱变的黑曲霉产的β- 葡萄糖苷酶活力提高了18.86 U/mL.该菌株最适宜产酶的培养基为(质量分数%): 麸皮与玉米粉(1∶1)1.5、 (NH 4 ) 2 SO 4 0.15、 KH 2 PO 4 0.2、吐温80 0.1,所得酶活力最大可达到59.86 U/mL.     

黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化及基本性质

设计了利用硫酸铵分级沉淀，凝胶过滤层析和羟基磷灰石吸附层析相结合及二次羟基磷灰石吸附层析二种分离方案，使一种黑曲霉β－Ｄ甘露聚糖酶得到纯化，纯化酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示基本为单一蛋白带。凝胶过滤法测的全酶相对分子质量为４９０００，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测得相对分子质量为５１０００．聚丙烯酰胺等电聚焦测得此纯化酶等电点为３．８．