脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的

背景：体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。 目的：构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。 方法：构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。 结果与结论：构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞及其表达研究

目的探讨胞嘧啶脱氨酶（CD）自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果。方法采用脂质体法将CD基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞，G418筛选阳性克隆（U251-CD），采用RT—PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪（FCM）凋亡分析和高效液相色谱（HPLC）等方法检测CD基因的表达及其功能。结果CD基因成功转染U251细胞。G418筛选获得阳性克隆．RT—PCR证实阳性细胞有CD基因表达，抗-CD-抗体免疫细胞化学法显示细胞浆染色阳性．U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶（5-FC）后，FCM显示细胞凋亡峰，HPLC可检测到5-FC培养液内有5-氟尿嘧啶（5-FU）产生。结论CD基因能够在U251细胞表达．并具备将5—Fc转变为5-Fu的功能，造成肿瘤细胞凋亡．CD-5-FC系统可作为恶性脑胶质瘤辅助治疗手段之一。     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞*☆

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18~20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用LipofectamineTM 2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达。 结果：质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度。流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体外实验研究

目的观察CDglyTK双自杀基因对C6胶质瘤细胞的杀伤作用及旁观者效应。方法利用逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)融合基因转染C6胶质瘤细胞,通过细胞集落形成试验、细胞生长抑制率(GIR)测定(MTT法),检测和分析CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)、HSV-tk/更昔洛韦(GCV)双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果RT-PCR检测分析融合基因的表达,显示逆转录病毒介导的双自杀基因在C6胶质瘤细胞中表达。不加5-FC和GCV时,转染组和对照组肿瘤细胞集落形成和倍增时间分别为94h、96h和25.7h、26.6h,组间差异比较无显著意义(P>0.05)。在5-FC(80.0mg/L)和GCV(10-1mg/L)浓度下,GIR分别为83.36%、7.08%,差异比较有显著意义(P<0.01)。转染C6胶质瘤细胞在混育细胞中比例占5%时,即可获得明显的旁观者效应,细胞生长抑制率可达38.48%。结论CDglyTK融合基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用。     

外源性IFN—β基因稳定转染对胶质瘤细胞凋亡的影响

目的研究外源性干扰素—β(IFN-β)基因对胶质瘤细胞系SHG-44的诱导凋亡作用，探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法利用脂质体转染方法将IFN-β真核表达载体pSV2IFNβ导入人SHG44胶质瘤细胞。应用流式细胞仪和免疫荧光法检测IFN-β基因的稳定转染及表达，利用Hoechst染色、透射电镜观察细胞凋亡情况。结果IFN-β基因成功转染SHG44胶质瘤细胞并得以表达，并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡。结论IFN-β能够诱导入SHG44胶质瘤细胞凋亡，本实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础。     

脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达。 结果：质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度。细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。 目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。 设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。 方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。 结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

真菌源性CD::UPRT联合基因治疗脑胶质瘤的实验研究

目的研究5-FC/CD：：UPRT联合基因治疗策略对胶质瘤细胞C6的杀伤效应。方法扩增yCD：：UPRT融合基因并构建含yCD：：UPRT基因的重组表达载体；载体转染包装细胞PT67,所获重组病毒转染胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆；用MTT法检测不同浓度5-FC对CD：：UPRT转基因细胞的杀伤效应。结果PCR法扩增出全长CD：：UPRT基因,经测序证实序列正确,重组逆转录病毒表达载体pLXSN-yCD：：UPRT经双酶切获目的条带,载体转染包装细胞获重组逆转录病毒(滴度达3．5×10~6CFU/ml)并转染C6,经筛选获得转基因阳性克隆C6-yCD：：UPRT细胞株,检测显示该细胞株有效表达目的基因。当5-FC终浓度≥10μmol/L时,实验组与对照组的细胞增殖力出现显著差异(P＜0．01),5-FC作用96h后电镜观察到凋亡小体。结论5-FC/yCD：：UPRT联合基因治疗策略对胶质瘤细胞C6有明显的杀伤作用。     

胶质瘤相关基因Tob的功能研究

目的研究Tob基因在胶质瘤细胞系SHG-44中的功能,为下一步进行试验性治疗提供依据.方法按照Tob基因的GenBank登录号D38305,构建带有绿色荧光蛋白（GFP）和新型抗生素Zeocin抗性基因的pTracer-EF/V5-His A表达载体.利用脂质体将上述表达质粒转入SHG44胶质瘤细胞.在各个不同的培养时段选择2、4、8、16、24、36、48 h分别在倒置显微镜下观察,最后在48 h时取未转染和转染的细胞大约105个作细胞涂片,进行荧光显微镜摄影和GFAP免疫组化染色分析.同时作体外生长曲线和细胞周期的流式细胞术分析.结果酶切鉴定和序列分析均证实Tob基因被成功克隆,将此基因成功转染到SHG-44细胞后,荧光显微镜观察可见用4μg脂质体和2μg DNA,最后用10μg/mLZeocin筛选可以达到90%的阳性细胞数.在转染Tob基因成功的细胞中GFAP染色的阳性率也同样升高.细胞在转染了Tob基因以后生长速度明显变慢,几乎处于停滞状态.流式细胞术分析显示在体外培养24 h后转染阳性细胞G2/M期比例明显减少,而凋亡细胞比例也出现明显的升高.结论Tob基因转染后的胶质瘤细胞生长受到明显抑制,出现向正常胶质细胞的分化和凋亡现象,提示Tob基因确实是一胶质瘤细胞增殖抑制基因,值得进一步做功能研究和实验性基因治疗研究.