肾综合征出血热病毒逆转录—聚合酶链反应检测方法的实…

选择覆盖肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）基因的保守区核苷酸序列合成引物，采用异硫氰酸胍一步法抽提ＲＮＡ，建立了逆转录（ＲＴ）聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测临床血清样本中ＨＦＲＳＶ ＲＮＡ的方法。扩增产物经凝胶电泳Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实了其具有特异性。结果显示ＨＦＲＳＶ阳性细胞培养液、１６份患者血清均为阳性，而１０份正常人血清均为阴性。该方法具高特异、高敏感的特点，为临床早期、快速诊     

深圳市肾综合征出血热患者汉坦病毒基因特征研究

目的 研究深圳市引起肾综合征出血热(HFRS)的汉坦病毒主要型别及分子特征,为该市汉坦病毒的防制提供依据.方法 收集各医院送检HFRS患者急性期血清标本,提取血清中病毒RNA作为模板,采用逆转录-套式PCR扩增汉坦病毒基因组M片段G2区基因并进行序列测定,对汉坦病毒进行基因分型和同源性分析.结果 深圳市HFRS病例男性多于女性,患者发病年龄主要集中在20-60岁,其中20-49岁病例数最多,共发病242例,占发病总数的85.82％.从282例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性4例,占1.42％;用SEO型特异性引物扩增阳性50例,占17.73％;总阳性率为19.15％.序列比较分析发现,深圳地区流行的SEO型汉坦病毒核苷酸序列的差异相对较小,其基因的离散度为0％-4.9％.从种系发生树看这些病毒分布在一个分支上,均为S2亚型.HTN型汉坦病毒的变异率较高,其基因的离散度为6.7％-21.0％,二例为H7亚型,二例为H9亚型,均为深圳市首次报道.结论 不同年份引起深圳地区HFRS的汉坦病毒仍以SEO型为主,且病毒变异较小,稳定性较高.首次发现HTN型病例存在.结合流行病学调查资料,证实HTN病例均为输入性病例.     

黑龙江地区肾综合征出血热患者中病毒基因检测及流行病学意义

目的进一步了解黑龙江地区HFRS患者中汉坦病毒的基因类别,同时对该病近年来的流行病学特征进行初步分析。方法采用RT-PCR技术对31份肾综合征出血热(HFRS)患者早期血清中的病毒进行基因分型,并根据患者发病季节分成两个感染时段,即冬季(2003年11月—2004年2月),春夏季(2004年4月—2004年9月),再结合临床症状综合分析。结果31份血清中,共有22份血清检测阳性,其中冬季感染时段14份血清,有8例检出阳性(Ⅰ型5例,Ⅱ型3例);春夏季感染时段17份血清,有14例检出阳性(Ⅰ型5例,Ⅱ型9例)。结论黑龙江地区不仅存在汉坦病毒基因Ⅰ型,且同时存在Ⅱ型;冬季以Ⅰ型为主,春夏季以Ⅱ型为主。     

关于肾综合征出血热疫苗的临床研究

流行性出血热，国际通称肾综合征出血热（HFRS），我国的发病数占整个世界的90％，是危害我国人民身体健康最严重的病毒性传染病之一。为预防控制本病，疫苗免疫是关键之举。自1978年和1981年，国内外先后分离出相关病毒后，各国研究者着手进行疫苗研究，经过20年的不懈努力，做了大量卓有成效的工作，取得非凡进展。尤其在我国更是举世瞩目：完成了3种单价疫苗和双价疫苗的研制，大规模现场使用取得很好的防病效果；在此基础上的各种双价纯化疫苗和Vero细胞双价纯化疫苗也已先后进入临床观察，获得很好的结果。下列相关的临床研究综述资料主要取自于国内的有关报道。     

烟台地区肾综合征出血热患者血清抗体检测和汉坦病毒序列测定

目的 了解烟台地区肾综合征出血热(HFRS)患者血清中IgG、IgM抗体水平，确定引起该地区HFRS流行的汉坦病毒的型别分布。方法 收集临床HFRS急性期和恢复期患者血清；用EMSA检测IgG、IgM抗体；用交叉空斑减少中和试验检测中和抗体；采用Trizol法提取患者血清中HFRS病毒RNA，用套式PCR产物做TA试验，测定核苷酸序列。结果 HFRS患者血清IgM阳性率为82．2％(88／107)，IgG阳性率为85．7％(66／77)。该地区两城市38份HFRS患者血清中，有32份属家鼠型病毒(SE0)感染，另6份未能定型；另一城市16份HFRS患者血清中，有15份属姬鼠型病毒感染，1份未定型。该地区HFRS病毒与SE0的同源性达90％以上。结论 引起烟台地区HFRS流行的汉坦病毒，属于以SE0为主的混合型病毒。     

血浆病毒载量检测在肾综合征出血热诊断中的作用研究

目的 探讨血浆病毒载量检测在肾病综合症出血热诊断中的临床价值,并对疾病进展、血浆病毒载量和cGDNA水平的相关性进行分析,为该病诊断及治疗提供理论依据.方法 选取西安医学院第二附属医院门诊2012年2月-2014年2月收治的41例肾综合征出血热患者进行研究,同时选取同期健康体检者40例作为对照,通过实时定量RT-PCR的方法来检测研究对象血浆中病毒载量,采用荧光染色法检测标本中cGDNA水平,分析其与患者的血浆病毒载量之间的相关性.结果 疾病早期病毒载量和血浆cf-DNA均有升高,当病程进展到多尿期时又有所下降直至正常水平.疾病早期重型或危重型患者血浆病毒载量和cf-DNA水平高于轻型和中型患者(P＜0.05),且患者血浆cf-DNA与血浆病毒载量呈正相关(r=0.76,P＜0.05).结论 血浆cf-DNA水平和病毒载量可用来预测疾病进展及预后.     

肾综合征出血热IgM抗体早期诊断两步法MacELISA的建立

目的 建立和改善肾综合征出血热早期诊断IgM抗体捕获MacELISA法.方法 汉坦病毒核蛋白重组表达纯化后用辣根过氧化物酶标记,建立一种以酶标抗原为基础的MacELISA(称为两步法MacELISA)并与常规三步法MacELISA进行比较分析.结果 检测不同病日HFRS患者血清IgM抗体比较两步法与三步法MacELISA高度相关,敏感性和特异性为100%,无有明显差别.结论 本方法操作简单,用时少,成本低,适合用于肾综合征出血热早期诊断和汉坦病毒感染的监测.     

肾综合征出血热病毒76－118株的反转录及聚合酶链反应扩增、鉴定的初步研究

用反转录和聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增了肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）７６－１１８株ＭＲＮＡ３＇－端２３７ｂｐ基因片段。制备了长臂光敏氨基已酸生物素标记的２３７ｂｐ探针。经琼脂糖电泳和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹，生物素－亲和素系统杂交和显色，对２３７ｂｐ扩增产物进行了特异性和灵敏性鉴定。ＰＣＲ技术与反转录技术相结合可用来对一些ＲＮＡ病毒进行研究和诊断，并能快速制备出质量较好的标记探针。     

汉坦病毒R36株的基因分型研究

采用汉坦病毒Ｍ片段特异性核苷酸分型引物，对Ｒ３６等７株汉坦病毒进行反转录和聚合酶链式反应扩增鉴定，结果Ｒ３６株仅能被Ⅰ型分型引物扩增出特异性片段，而不能被Ⅱ型引物扩增；ＰＣＲ产物的序列分析结果表明，Ｒ３６与ＨＴＮ型病毒７６－１１８株的同源性为７８．４％，与ＳＥＯ型病毒Ｒ２２株的同源性为６８．１％。文中对Ｒ３６与汉坦病毒其它毒株的核苷酸同源性进行了配对比较。该项研究为从核苷酸水平对Ｒ３６株的分型，提供了科学依据。     

肾综合征出血热病毒逆转录－聚合酶链反应检测方法的实验研究和临床意义

选择覆盖肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）基因的保守区核苷酸序列合成引物，采用异硫氰酸胍一步法抽提ＲＮＡ，建立了逆转录（ＲＴ）聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测临床血清样本中ＨＦＲＳＶＲＮＡ的方法。扩增产物经凝胶电泳及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实了其具有特异性。结果显示ＨＦＲＳＶ阳性细胞培养液、１６份患者血清均为阳性，而１０份正常人血清均为阴性。该方法具高特异、高敏感的特点，为临床早期、快速诊断，并从分子生物学角度鉴定ＨＦＲＳＶ提供了新手段。     

利用双扩增聚合酶链反应检测非甲非乙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒RNA

利用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’－端序列合成两对引物，建立了灵敏、特异的ＨＣＶＲＮＡ双扩增聚合酶链反应检测方法。用此方法及第二代Ａｂｂｏｔｔ酶联抗－ＨＣＶ检测试剂盒，检测了４４例非甲非乙型肝炎患者血清及１０名抗－ＨＣＶ阴性健康人。在４４例患者中，４１例（９３％）ＨＣＶＲＮＡ阳性，３６例（８２％）抗－ＨＣＶ阳性，３３例（７５％）ＨＣＶＲＮＡ、抗－ＨＣＶ全部阳性。３例ＨＣＶＲＮＡ阴性，但抗－ＨＣＶ阳性，另外，有８例抗－ＨＣＶ阴性，ＨＣＶＲＮＡ阳性。１０名健康人ＨＣＶＲＮＡ均为阴性。结果表明，大部分（９２％）抗－ＨＣＶ阳性患者带有ＨＣＶ，但为了检测所有病毒血症患者，抗－ＨＣＶ检测是不够的，利用双扩增ＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ对于抗－ＨＣＶ阴性患者的诊断是非常有用的。     

聚合酶链式反应生物芯片/微装置技术在疾病诊断中的应用

聚合酶链式反应（Polymerase chaim reaction，PCR）技术已经在分子生物学、疾病诊断等领域得到广泛应用。PCR生物芯片／微装置由于具有所需样品和反应混合物体积小、反应时间短、轻便等优点倍受人们关注。本文综述了PCR生物芯片／微装置在疾病诊断领域中的应用，并对其应用和发展作出了展望。     

肾综合征出血热患者软腭粘膜对乳鼠致病性的研究

目的探讨肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）的发病机理。方法２～３天的近交系Ｂａｌｂ／Ｃ乳鼠,脑内接种早期ＨＦＲＳ重症患者软腭粘膜出血点组织悬液,用套式聚合酶链式反应检测乳鼠脑、肺及肾组织中的ＨＦＲＳ病毒ＲＮＡ。结果接种乳鼠发病死亡,剖检显示,发病乳鼠各器官呈现明显微血管系统和实质组织病变,乳鼠脑、肺及肾组织中ＨＦＲＳ病毒ＲＮＡ阳性。结论早期ＨＦＲＳ患者软腭粘膜出血点组织中含有ＨＦＲＳ病毒。     

由特异基因扩增产物制备丙型肝炎病毒cDNA探针

应用逆转录聚合酶链反应技术自丙型肝炎病毒感染血浆中扩增ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，经寡聚核苷酸探针杂交鉴定后以低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，微柱亲和层析纯化，用于缺口平移制备＾３２Ｐ标记的ＨＣＶ基因探针，这种探针用于斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测非甲非乙型肝炎血产乐的ＨＣＶ基因扩增产物，能鉴定ＨＣＶ序列的特异性，且分别达到０．１ｐｇ和１ｐｇ的敏感性。     

用热启动聚合酶链反应检测血清中乙型肝炎病毒DNA技术的建立和应用

建立了热启动聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）的技术。ＰＣＲ所有反应成分被２次加样。先加Ａ液（含ｄＮＴＰｓ、一对引物和ＭｇＣｌ＿２）与一粒石蜡珠。７０℃加热后冷却至室温，使蜡珠先融化后凝固形成蜡盖封住Ａ液，然后在向其上加入Ｂ液（含耐热性ＤＮＡ聚合酶、ＨＢＶＤＮＡ模板和ＫＣｌ）并开始循环扩增。当反应管内第一次变性温度升至６０℃以上时，中隔蜡层融化，蜡上浮形成防蒸发屏障，Ａ、Ｂ两液则由于热分子运动而混匀，从而保证引物与靶基因在较高温度下严格退火以减少错导非特异性扩增和引物聚体形成。提高了ＰＣＲ的特异性和灵敏性，应用这种技术对７６例肝炎血清进行了检测，结果ＨＢＶＤＮＡ检出率为６８％，其中ＨＢｓＡｇ（＋）、ＨＢｅＡｇ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为１００％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢｅ（＋）、抗－ＨＢｃ（＋）血清检出率为７０％；ＨＢｓＡｇ（＋）、抗－ＨＢＣ（＋）血清检出率为８９％；抗ＨＢＣ（＋）血清检出率为对％；标记全阴性血清检出率为３３％。     

聚合酶链反应在前列腺癌诊断中的应用

着重介绍反转录PCR(RT-PCR)检测前列腺肿瘤标志物如前列腺特异抗原(PSA)和α-甲酰基辅酶A消旋酶(AMARC)诊断前列腺癌的意义及进一步研究的方向。还介绍了利用甲基化特异性PCR技术检测π类谷胱苷肽-S-转移酶I(GSTP1)CpP岛甲基化程度在诊断前列腺癌中的意义。     

用通用引物聚合酶链反应对宫颈刮片中人乳头瘤病毒感染的快速筛检

用通用引物聚合酶链反应（ＧＰ－ＰＣＲ）可同时对人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）６、１１、１６、１８、３１、３３等型进行检测。该方法成功地用于临床宫颈刮片样品广谱ＨＰＶ感染的筛检。结果，宫颈癌组ＨＰＶ检出率（８５．５％）明显高于非癌组（１３．９％）（Ｐ＜０．０１）；对宫颈癌放疗前后ＨＰＶ阳性率比较，二者亦有明显差异（８５．５％，４３．７％，Ｐ＜０．０１）。证明ＧＰ－ＰＣＲ是一种在大规模人群中快速筛检多型ＨＰＶ感染的有效方法。