丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１）经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析证实     

HCV5’－NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所用产物分子量均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带有和克隆位点融合所产生的两个外源ＮｃｏＩ切点也存在；证实ｐＵＨＣＶ－ＮＣ中克隆基因是ＨＣＶ的５’ＮＣＲ序列且插入方向为反向。应用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，粘端插入ｐＳＰ７２的多克隆位点，均建了ｐＳＨＣＶ－ＮＣ转录重组体，对之进行了ＰＣＲ和酶切鉴定。     

中国HCV一株NS5区部分基因克隆及序列分析

目的：研究ＨＣＶ ＮＳ５基因的结构与功能，为进一步研制适合我国使用的第３代抗－ＨＣＶ试剂打下基础。方法：自行设计引物，从河北固安县慢性丙型肝炎患者血中，用逆转录－聚合酶链反应扩增出ＨＣＶ ＮＳ５基因，并将其克隆到载体ｐＫＰＬ－３ａ，经Ｄｏｔ ｂｌｏｔ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和限制性内切酶分析筛选出阳性克隆ｐＫＨＣ－５ａ，进行序列测定。结果：核苷酸序列分析表明，克隆的ＨＣＶ ＮＳ５基因与ＨＣＶⅡ     

肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒NS_5抗原的免疫组织化学观察

肝癌及癌旁组织中丙型肝炎病毒ＮＳ５抗原的免疫组织化学观察汪荣泉周子成杨建民房殿春我们采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶连接法（ＳＰ法）和ＨＣＶＮＳ５的单克隆抗体、ＨＢｓＡｇ的多克隆抗体对肝癌（ＨＣＣ）及其癌组织中ＨＣＶＮＳ５抗原和ＨＢ－ｓＡｇ的表达进行...     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

HCV E2／NS1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基因亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，     

乙型和丙型肝炎重叠感染患者肝组织免疫组织化学双标记研究

探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）重叠感染患者肝组织中病毒的复制状况和相互关系。方法采用免疫组织化学双标记技术，以抗－ＨＣＶＮＳ３、抗－ＨＣＶＮＳ５单克隆抗体和抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｃ多克隆抗体，检测２５例尸检肝组织中ＨＣＶＡｇ和ＨＢＶＡｇ的分布和表达。结果ＨＢ－ｓＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ同时阳性１１例，ＨＢｓＡｇ和ＮＳ５Ａｇ阳性１２例，ＨＢｃＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ及ＨＣＶＮＳ５Ａｇ阳性各１０例。几乎所有单标记染色阳性切片，其双标记染色也阳性。感染ＨＣＶ或ＨＢＶ的肝细胞各呈灶性、散在或弥散混杂分布，在重叠感染肝组织中，与ＨＢＶ复制有关的表达类型，如ＨＢｓＡｇ膜、浆型和ＨＢｃＡｇ浆型以及ＨＣＶＮＳ３Ａｇ和ＨＣＶＮＳ５Ａｇ的检出例数，同单纯感染组相比差异无显著意义（χ２＝０．１５４及０．１９８，Ｐ＞０．０５）。结论乙型和丙型肝炎病毒在重叠感染时，两种病毒在肝组织内可能不存在互相干扰和抑制。     

乙型和丙型肝炎重叠感染患者组织免疫组织化学双标记研究

探讨丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒重叠感染患者肝组织中 复制状况和相互关系。方法采用免疫组织化学双标记技术，以抗－ＨＣＶ ＮＳ３，抗－ＨＣＶＮＳ５单克隆抗体和抗－ＨＢｓ，抗－ＨＢｃ多克隆抗体，检测２５例尸检肝组织中ＨＣＶＡｇ和ＨＢＶＡｇ的分布和表达。     

原发性肝癌中HBV X,S,Pre—S,C基因片段整合与ras,myc癌基因 …

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶ ＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶ Ｘ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶ Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、     

HCVE＿2／NS＿1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５’非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基围亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，在ＨＣＶ－Ｓ１片段的３’端有一３６个核苷酸的区域，其变化可能具有型特异性     

裸DNA骨骼肌注射表达外源基因条件的初步研究

目的观察裸ＤＮＡ直接骨骼肌注入表达外源基因的条件。方法以真核表达质粒为载体将报告基因β－ｇａｌ导入骨骼肌细胞,冰冻切片后Ｘ－ｇａｌ染色检测β－ｇａｌ基因表达水平。结果所测质粒ＤＮＡ溶剂类型中,生理盐水最有利于β－ｇａｌ表达;表达水平与注射ＤＮＡ的含量呈剂量依赖性;注射体积对表达影响不明显。结论ＤＮＡ溶液中的溶质成份影响外源基因在肌肉中的表达,优选这些成份可进一步提高肌注后基因表达水平。     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

PTEN基因在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达

①目的　探讨卵巢子宫内膜异位症 (内异症 )组织中PTEN基因表达及临床意义。②方法　用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,检测内异症组织和正常卵巢组织中PTEN基因外显子 1 9和 5 9mRNA的表达水平 ,同时结合病人的临床资料进行分析。③结果　内异症组织中PTENmRNA外显子 1 9、5 9相对表达水平与正常卵巢组织比较 ,差异有显著性 (t=3.12 2、2 .2 0 9,P <0 .0 1、0 .0 5 )。内异症组织中PTENmRNA表达水平与病人年龄、囊肿大小无关 (t =0 .111～ 1.4 4 7,P >0 .0 5 ) ;与临床分期有关 (t =2 .6 78、2 .2 84 ,P <0 .0 5 )。④结论PTENmRNA转录水平的异常可能是内异症恶变的早期事件。     

BAX基因在遗传不稳定的大肠癌,胃癌突变的研究

目的：了解Ｂａｘ基因在大肠癌,胃癌的突变情况。方法：用ＱＩＡａｍｐ方法提取肿瘤和正常组的ＤＮＡ,选择５对引物,经ＰＣＲ扩增,走ＤＮＡ序列胶电泳,检测其ＭＩ及Ｂａｘ基因编码区序列。结果：胃癌有８例ＭＩ阳性,其中３例Ｂａｘ基因有突变,大肠癌有１４例ＭＩ阳性,其中６例Ｂａｘ基因有突变。结论：Ｂａｘ基因突变在胃癌和大肠癌的发生过程中起重要作用,Ｂａｘ基因是胃癌、大肠癌ＭＩ＾＋的遗传改变受累的一个靶基因。     

EFFECTS OF MUTATION AND EXPRESSION OF PTEN GENE mRNA ON TUMORIGENESIS AND PROGRESSION OF EPITHELIAL OVARIAN CANCER

PTEN/MMAC1/TEP1phosphotaseandtensinho-mologuedeletedonchromosome10/mutatedinmultipleadvancedcancers/TGF-βregulatedandepit-helialcellenrichedphosphatase1mapstohumanchro-mosomesubband10q32.3andencodesadualspecificproteinphospholipidphosphatasethatisinvolvedinavarietyofsignaltransductionpathways.1PTENin-hibitsshc'sphosphorylationandthereforeblockstheactivationoftheRas/MAP-kinaseMAPKpathwayhe-nceexplainingthetumorsuppressiveeffectofPTEN.2AnothermechanismofPTENisdephosphorylationandina…     

人血管内皮生长因子基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段。构建pcDNA3／VEGF165真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株SMMC-7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建成pcDNA3／VEGF165重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人VEGF165cDNA。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因并构建了其真核表达质粒。为进一步研究用VEGF基因转染的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

RNA-DNA杂交法研究乳酸脱氢酶-C基因在睾丸中特异性表达

用同位32~P标记乳酸脱氢酶-C(LDH-C)cDNA作为探针,与小鼠胸腺、脑、胰、心肌、骨骼肌、睾丸、肾、肺、肝的RNA以及人胰、皋丸、肝、骨骼肌、心肌及脑的RNA分别作点溃杂交(dot blot hybridization)及Northern印迹杂交,证实LDH-C基因只在睾丸中特异性表达。     

抗癌基因失活与葡萄胎恶变的关系

为探讨ｐ５３及ｎｍ２３抗癌基因失活与葡萄胎恶变的关系，对８２例葡萄胎、３０例侵蚀性葡萄胎和３０例绒癌石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色分析。８２例葡萄胎中，未发生恶变３２例，恶变５０例。恶变组葡萄胎中ｐ５３基因的表达明显强于非恶变组（Ｐ＜０．０５），ｎｍ２３基因的表达显著低于非恶变组（Ｐ＜０．００１）。不同来源的绒癌之间以及绒癌和侵蚀性葡萄胎之间ｐ５３和ｎｍ２３基因的表达差异无显著性（Ｐ均＞０．０５）。ｐ５３及ｎｍ２３基因的失活与葡萄胎恶变有关，但与葡萄胎恶性转化方向无关     

胃癌组织p16／MTS1基因缺失研究

应用多重ＰＣＲ技术分析了２８例胃癌组织ｐ１６基因第２外显子缺失情况。结果显示，胃癌组织ｐ１６基因第２外显子缺失率达１４．３％（４／２８），且伴有ｐ１６基因缺失的胃癌均有周围器官的转移。提示ｐ１６基因缺失与胃癌发生发展有关，ｐ１６基因缺失患者易发生周围器官转移，预后不良。     

STUDY OF LOSS OF HETEROZYGOSITY AT DCC AND APC/MCC GENETIC LOCI OF GASTRIC CANCER

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＩｎｔｈｅｃｏｕｒｓｅｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｍｏｒｓ,ｔｈｅｌｏｓｓｏｆｃｅｒｔａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆａｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｒｅｇｉｏｎｆｒ...