人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA.获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3.1（＋）-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响.以空白质粒转染组作为对照.结果在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因.6-10B在转染了pcDNA3.1（＋）-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1（＋）,肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低（P＜0.05）.结论结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因.获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

表达人KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型的建立

目的建立表达人KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,为探究人KIAA1173基因在鼻咽癌发病机制中的作用奠定实验基础。方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR(RT-PCR)得到人KI-AA1173基因cDNA,纯化PCR产物,与真核表达载体pcDNA3.1( )连接,转化,铺板,筛选阳性克隆,酶切鉴定并进行序列测定。将重组质粒pcDNA3.1( )-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆。用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况。以空白质粒转染组作为对照。结果重组质粒pcDNA3.1( )-KIAA1173经酶切和DNA测序分析显示与GenBank所公布的相应序列相符,插入方向正确,阅读框架完整。转染KIAA1173基因的6-10B细胞阳性克隆在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有该基因高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因。结论成功获得了人KIAA1173基因全长cDNA的基因克隆,将该基因导入鼻咽癌6-10B细胞后,获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的细胞模型。     

KIAA基因家族的研究进展

人类基因组计划实施和完成过程中,不断地发现KIAA基因,这是一类新识别的大片段cDNA,可编码巨大蛋白质,而对巨大蛋白质的功能研究已经成为后基因组计划的一大主题.该文就KIAA基因家族数据库的建立、序列特征、功能分类、研究新进展作一综述.     

KIAA基因家族的研究进展

人类基因组计划实施和完成过程中，不断地发现KIAA基因，这是一类新识别的大片段cDNA，可编码巨大蛋白质，而对巨大蛋白质的功能研究已经成为后基因组计划的一大主题。该文就KIAA基因家族数据库的建立、序列特征、功能分类、研究新进展作一综述。     

荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

[目的]研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异，克隆出与脑缺血相关的基因。[方法]应用荧光差异显示PCR(FDD PCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段，经反向Northern blot杂交，将杂交阳性的片段且经RT—PCR反复验证，选取差异明显的片段进行克隆测序：经生物信息学分析处理，选取同源性低的EST片段R6，利用cDNA5′端快速扩增PCR(5′RACE法)进行基因全长的克隆。[结果]利用5′RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区，扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF)，RT—PCR及Northern blot印迹结果证实了克隆的结果，同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源，同源性96％，编码166个氯基酸，为结构及功能未明确蛋白质，该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q．13)。[结论]应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KAA0280相似的基因，其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调，该蛋白质结构及功能均未见报道及研究，其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。     

KIAA0101基因在人非小细胞肺癌中的功能预测

目的应用生物信息学分析方法对肺癌组织中高表达的基因KIAA0101进行功能预测与分析。方法通过dChip软件对人肺癌基因表达谱数据集中癌旁组织与癌组织两组样本进行比较,筛选出与KIAA0101基因共表达的差异基因。运用DAVID、GO、STRING等生物信息学软件对筛选基因进行生物学功能分析,并通过GATHER转录因子预测软件预测该组基因的共同转录因子。结果与癌旁正常组织比较,肺癌组织中KIAA0101等9个基因表达水平升高两倍以上,并且具有相似表达变化趋势;转录因子预测发现该组多数基因启动子区含有转录因子E2F1结合位点。结论筛选出人非小细胞肺癌组织中与KIAA0101基因共表达的一组基因,其中BUB1B、CDC20、CCNB2等基因与细胞周期的调节密切相关,推测KIAA0101基因可能参与肺癌细胞周期的调节,并且该组基因转录水平表达升高可能受转录因子E2F1的调控。     

KIAA1199基因的研究进展

随着人类基因组学进入了后基因组计划,研究人类基因组所蕴藏的遗传信息,探索其具有的功能成为重要的方向之一。HUGE蛋白质数据库的建立正式这个方向的代表。它具有代表性的KIAA基因家族因其编码一些重要的蛋白而为人重视,其中KIAA1199基因因其与多种肿瘤的发生、发展密切相关而备受关注。本文就KIAA1199基因的结构、认识、研究新进展而作一综述。     

心脏发育候选致病基因KIAA0196斑马鱼品系的建立及初步机制研究

目的：探究KIAA0196基因对心脏发育的影响及斑马鱼品系的建立。方法：提取先天性心脏病患者外周 血和gDNA,采用拷贝数变异和靶向序列分析筛选出候选致病基因。用CRISPR/Cas9技术建立KIAA0196基因敲除斑 马鱼品系。对野生型和突变型斑马鱼进行解剖和组织学染色,观察心脏形态、大小及环化方向等表型。结果：通过 CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼KIAA0196基因敲除品系。受精后60 h,突变个体(杂合子+纯合子)显微镜检查显 示心包积液、心脏受压和尾部严重卷曲。突变型斑马鱼与野生型相比,心脏存在心房缩小,心室增大,心肌细胞更 加松散等缺陷。结论：KIAA0196基因在心脏发育过程中起重要的调控作用,该基因可能为先天性心脏病的致病候选 基因。     

人GDNF基因的克隆

目的：克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法：从脑胶质细胞瘤患者术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴＰＣＲ方法扩增出了一段约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的人ＧＤＮＦ基因。与发表于ＧｅｎｅＢａｎｋ上的序列相比，发现该研究克隆的基因有一段７８ｂｐ的核苷酸序列缺失，但不影响密码子的阅读框。结论：克隆到了编码正确的人ＧＤＮＦ的ｃＤＮＡ全序列，对帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义。     

人、仓鼠和牛PrPc基因的克隆及表达

目的：获得不同物种PrP基因与蛋白抗原，用于可传播性海绵样脑病的研究。方法：以外周血中提取的人、仓鼠和牛基因组DNA为模板，PCR扩增并克隆人PrP(23～231)、仓鼠PrP(23～231)、牛PrP(25-242)基因。以pGEMCS为表达载体，M15大肠杆菌中分别表达人PrP(23～231)、仓鼠PrP(23～231)及牛PrP(25-242)-GST融合蛋白，用Western blot鉴定所表达蛋白。结果：克隆了人PrP(23～231)、仓鼠PrP(23-231)及牛PrP(25-242)基因，测序结果与报道序列一致，在原核细胞中高效表达了人、仓鼠及牛PrP-GST融合蛋白，Western blot结果显示，所表达蛋白为人、仓鼠及牛PrP。结论：获得了人、仓鼠和牛的PrP基因，原核细胞中可高效表达人、仓鼠、牛PrP-GST融合蛋白。     

肿瘤相关基因KIAA1173在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的 探讨KIAA1173基因在皮肤鳞状细胞癌(SSCC)中表达的临床与病理意义.方法 克隆KIAA1173基因片段(354 bp),并制备cDNA探针;采用原位杂交检测133例SSCC患者肿瘤组织(52例Ⅰ级、37例Ⅱ级、31例Ⅲ级和13例Ⅳ级)和47份正常表皮中KIAA1173基因mRNA的表达情况,并分析其与临床病理因素的关系.结果 KIAA1173基因阳性定位在实质细胞胞质内,在SSCC中阳性表达率为3 8. 3%(51/133),在正常表皮组织中的阳性表达率为93.6%(44/47),两者比较差异有统计学意义(x2=42.567,P＜0.01);正常表皮组的强阳性表达率为48.9%(23/47),SSCC组为6.0%(8/133),两者比较差异有统计学意义(x2=44.876,P＜0.01);KIAA1173基因在SSCC I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级的表达缺失率分别为53.8%(28/52)、62.2%(23/37)、67.7%(21/31)和76.9%(10/13),差异无统计学意义(x2=4.005,P＞0.05);分化较差组的表达缺失率70.5%(31/44)高于分化较好组57.3%(51/89),但两者比较差异无统计学意义(x2=2.154,P＞0.05).结论 KIAA1173基因在正常皮肤和SSCC不同分化程度中表达不同,KIAA1173基因可能参与SSCC的演变过程.     

CD44重组表达抑制鼻咽癌6-10B细胞增殖

目的：探索CD44v10剪接变异体对鼻咽癌细胞增殖的生物学作用.方法：将CD44v10基因编码序列重组,构建pIRESne03-CD44v10重组质粒表达载体,重组表达载体扩增后采用脂质体转入鼻咽癌6-10B细胞系,G418筛选稳定转染细胞株;RT-PCR和蛋白印迹鉴定CD44v10重组表达6-10B细胞株;MTT法分析细胞增殖.结果：获得了CD44v10稳定重组表达的6-10B细胞株;CD44v10表达抑制6-10B细胞增殖.结论：CD44v10表达对鼻咽癌细胞的恶性增殖可能具有抑制作用.     

鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B的差异蛋白质组学研究

目的:比较不同转移潜能的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞系5-8F和6-10B细胞蛋白质组的差异,筛选NPC转移相关蛋白质.方法:应用二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术分离具有相同遗传背景、不同转移潜能的鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质,Western免疫印迹方法验证部分差异蛋白质在2株细胞中的表达水平.结果:建立了5-8F和6-10B细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了65个差异表达的蛋白质点,鉴定了15个非冗余的差异表达蛋白质.Western免疫印迹分析证实了差异蛋白质膜联蛋白A1和14-3-3 protein sigma在5-8F和6-10B细胞中的差异表达水平.结论:15个非冗余的差异表达蛋白质为研究NPC转移机制提供了实验依据.     

A73基因的克隆及其编码区序列分析

目的 克隆Epstein-Barr（EB）病毒A73基因，并分析其编码区序列变异情况，为进一步研究其生物学功能提供基础。方法 从7例鼻咽癌组织中分别提取其总RNA，以RT-PCR扩增A73基因编码序列，将其克隆入pGEM-T-Easy载体进行测序，以Blast软件在Genbank数据库中对其进行序列分析。结果 成功克隆了高发区鼻咽癌的A73基因，序列分析表明该基因编码序列第45nt发生A→C的碱基替换，该变异位于第VB外显子的157154nt，未引起相应第15位氨基酸的替换（CCA→CCC，P→P），其变异频率为7／7。结论 高发区鼻咽癌EB病毒A73基因的编码序列存在变异，该变异属于鼻咽癌相关的多态性，有可能参与EB病毒某亚型的构成。     

鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的基因表达谱分析

目的区分不同转移能力的鼻咽癌细胞亚群,对于探讨鼻咽癌转移的分子机制、脏器亲和性具有重要的临床和生物学意义。我们拟应用基因芯片技术来分析鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的基因表达谱差异。方法分别提取鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的总RNA,逆转录成荧光标记的cDNA,与Af-fymetrix Human Genome U₁33A 2.0寡核苷酸芯片杂交（每株重复3次）,用专业的软件和聚类分析法分析基因表达谱。结果得到差异表达基因3767个,其中差异表达2倍以上的基因281个,进一步筛选出16个可能与鼻咽癌肝转移关系密切的基因16个。结论这16个基因能够很好的区分5-8F-EGFP和肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP,为进一步寻找鼻咽癌肝转移的临床分子标志物、判断预后缩小了范围。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达

目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.