布鲁氏菌的脂肪酸分型研究

目的探索脂肪酸分型方法对布鲁氏菌进行分型的可能性。方法选择90株布鲁氏菌经化学方法提取菌体脂肪酸后,用气相色谱分析,获得布鲁氏菌脂肪酸成分的数据资料。并利用SPSS11.5统计软件对获得的数据资料进行聚类分析。结果布鲁氏菌脂肪酸分型方法将90株布鲁氏菌分为5组:第1组为部分牛种菌;部分羊种菌;部分猪种菌;部分绵羊附睾种;部分变异牛种;部分变异羊种;沙林鼠种标准株。第2组为猪种1、2、3、5型标准株和疫苗株S2;羊种疫苗株M28和Rev.1;绵羊附睾种标准株。第3组为部分羊种;部分变异羊种菌;部分牛种3型和6型;犬种;部分绵羊附睾种。第4组为犬种菌标准株。第5组为部分羊1型;部分变异羊种;部分牛1型;部分猪1型和3型。结论依据布鲁氏菌菌体脂肪酸含量差异可以对布鲁氏菌进行分型;依据19∶0CYCLOω8c,18∶1ω7c,16∶0三种脂肪酸含量差异可以区分猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌;脂肪酸分型结果进一步提示犬种布鲁氏菌不只1个生物型;脂肪酸分型结果进一步证实牛3型和牛6型布鲁氏菌高度同源。     

羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M的比较蛋白质组学研究

目的阐明羊种布鲁氏菌疫苗株M5致弱的分子基础,更加深入地理解布鲁氏菌的毒力机制。方法利用双向电泳技术对相同条件下培养的羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M总蛋白进行分离,两株间差异蛋白点利用基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱技术进行鉴定。每个蛋白质点的肽指纹图谱均使用Mascot在NCBInr蛋白质数据库中进行检索。结果共成功鉴定了13个差异蛋白,代表了8种不同的开放阅读框(ORFs),功能涉及能量代谢,应激,物质运输等。结论上述发现为羊种布鲁氏菌疫苗株M5致弱分子基础的阐明提供了新依据。     

河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究

目的检测与分析河南省2010-2012年20株布氏菌型别及PFGE脉冲场凝胶电泳指纹图谱特征。方法采集病人静脉血,分别以试管凝集试验(SAT)、双相血培养瓶分离培养、热裂解法制备DNA模板和AMOS-PCR鉴定4种布氏菌型别。采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对检出的布鲁氏菌进行分子分型鉴定。结果分离培养的20株布鲁氏菌经鉴定,19株为羊种,1株为牛种;羊种布鲁氏菌经XbaI酶切与脉冲场凝胶电泳后,共获得了8种不同带型,带型相似度在80%~100%之间,牛种与羊种菌株在带型相似度上差异较大,具有较好的分辨能力。结论河南省病人感染的布鲁氏菌以羊种为主要型别,AMOS-PCR与PFGE作为布鲁氏菌菌型鉴定与分子分型的技术手段,为布鲁氏菌病的病原学监测与应急检测提供依据。     

河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究北大核心CSCD

目的 检测与分析河南省2010-2012年20株布氏菌型别及PFGE脉冲场凝胶电泳指纹图谱特征。方法 采集病人静脉血,分别以试管凝集试验（SAT）、双相血培养瓶分离培养、热裂解法制备DNA模板和AMOS-PCR鉴定4种布氏菌型别。采用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对检出的布鲁氏菌进行分子分型鉴定。结果 分离培养的20株布鲁氏菌经鉴定,19株为羊种,1株为牛种;羊种布鲁氏菌经XbaI酶切与脉冲场凝胶电泳后,共获得了8种不同带型,带型相似度在80%~100%之间,牛种与羊种菌株在带型相似度上差异较大,具有较好的分辨能力。结论 河南省病人感染的布鲁氏菌以羊种为主要型别,AMOS-PCR与PFGE作为布鲁氏菌菌型鉴定与分子分型的技术手段,为布鲁氏菌病的病原学监测与应急检测提供依据。     

鼠疫疫苗株脉冲场凝胶电泳操作规范的建立

目的建立鼠疫菌脉冲场凝胶电泳的操作规范,并对操作进行风险评估。方法应用疫苗株EV76进行实验,比较不同培养时间、两种酶切的电泳图形,以及胶块中细菌存活情况的检测。结果不同培养时间对电泳结果没有影响,FseI酶切图谱条带较容易分析,胶块内无细菌存活。结论严格执行标准操作程序,才能确保鼠疫菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)操作的实验室生物安全。     

吉林省小肠结肠炎耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳分析

目的对小肠结肠炎耶尔森氏菌全DNA进行酶切，了解吉林省小肠结肠炎耶尔森氏菌在核酸水平的差异。方法用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法进行分析。结果用PFGE将33株小肠结肠炎耶尔森氏菌分成7个核型，其中0：3血清型分出5个核型；0：9血清型2个核型。结论提示脉冲场凝胶电泳分析可用于小肠结肠炎耶尔森氏菌遗传关系的研究，以及分析暴发流行和常规监测，追踪传染源。     

布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5-90诱导巨噬细胞凋亡线粒体途径相关因子的表达比较

目的比较布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后其凋亡相关因子的转录和表达。方法建立16M、M5-90侵染RAW264.7模型,采用CFU计数法比较16M、M5-90侵染RAW264.7 4、8、12、24h后的胞内生存情况;采用qRT-PCR检测AIF、Bcl-2、Bax、Apaf-1、Bcl-xl基因转录水平的变化;采用ELISA检测TNF-α和Cyt C在细胞内的表达;采用激光共聚焦检测Cyt C在细胞内共定位表达情况。结果布鲁氏菌16M在侵染后4h~24h胞内CFU呈增多趋势,而M5-90CFU先增多后减少。qRT-PCR显示AIF基因的转录水平在侵染后4h~24h内呈上升趋势,且M5-90侵染组与16M侵染组比较差异无统计学意义(P0.05);由M5-90侵染诱导的Apaf-1基因转录水平与16M侵染组比较有统计学意义(P0.05);Bcl-xl的转录量随着侵染时间增长而不断增加,且16M诱导组与M5-90组比较差异无统计学意义(P0.05);M5-90侵染组Bax和Bcl-2水平与16M组比较差异均有统计学意义(P均0.05);M5-90侵染组Bax/Bcl-2比值与16M侵染组比较差异无统计学意义(P0.05)。ELISA分析显示TNF-α、Cyt C分泌量随着时间增长而增加,且M5-90诱导组与16M组比较差异无统计学意义(P均0.05)。激光共聚焦显示Cyt C定位在RAW264.7内,属于胞浆表达,且M5-90诱导的表达量与16M组比较差异无统计学意义(P0.05),并随感染时间的延长不断增加。结论布鲁氏菌疫苗株M5-90侵染RAW264.7 4h~24h内,凋亡相关因子Cyt C、AIF、Bax/Bcl-2、Apaf-1的表达量高于强毒株16M侵染组,而Bcl-xl则相反,表明在此侵染阶段M5-90具有更强的促细胞凋亡作用。     

云南鼠疫耶尔森氏菌脂肪酸成分分析

目的利用脂肪酸成分分析方法获得云南鼠疫耶尔森氏菌菌株脂肪酸组成的本底资料,并建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的数据库。方法选择历年来从云南不同疫源地分离到的146株鼠疫耶尔森氏菌进行了菌体脂肪酸成分分析。结果云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的主要脂肪酸成分为16∶0酸,环式17∶0酸,3羟基14∶0酸和ω7 c16∶1酸以及十八碳单烯酸,与宋亚军等的分析结果一致,与M ID I公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异。结论建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的脂肪酸组成数据库。     

鼠疫耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳分析

目的 对鼠疫菌的全DNA进行酶切，了解我国各别生态型的鼠疫耶尔森氏菌在核酸水平上的差异。方法 用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分析。结果 用PFGE可将20株鼠疫菌分成5个核型，I型为布氏田鼠型和青海田鼠型菌；Ⅱ型为滇闽居民区型菌和滇西丛谷型菌；Ⅲ型为祁连山型、青藏高原型和1株分离自四川患的鼠疫菌。西藏仲巴地区的2株菌各为一个型。结论 提示脉冲场凝胶电泳分析可用于鼠疫耶尔森氏菌遗传关系的研究。     

广东省布鲁氏菌菌株脂肪酸成分分析

目的探讨脂肪酸成分分析方法对广东布鲁氏菌菌株进行分型的可能性,获得广东布鲁氏菌脂肪酸成分的本底资料。方法选择历年从广东不同地区分离到的29株布鲁氏菌进行了菌体脂肪酸成分分析,利用MIDI公司Sherlock系统的软件进行聚类分析。结果广东布鲁氏菌的主要脂肪酸成分为19：0cycloω8c酸、16：0酸、18：0酸,其中牛种菌的19：0cycloω8c酸含量最高,羊种次之,猪种最低,其中羊种和猪种布鲁氏菌19：0cycloω08c酸、18：0酸含量差异有统计学意义,1965年和近3年的羊种布鲁氏菌株19：0cycloω8c酸、18：0酸含量差异有统计学意义。结论菌株的脂肪酸成分稳定,但各种间脂肪酸含量存在差异,一定的欧氏距离时,可以在种的水平上区分布鲁氏菌的3个种。     

布鲁氏菌疫苗株S2全基因组测序及牛羊布鲁氏菌比较基因组学研究

目的 为了了解布鲁氏菌S2疫苗株全基因组结构及分子生物学功能。方法 对布鲁氏菌疫苗株S2进行全基因组测序,并与GenBank公布的6株牛羊布鲁氏菌进行比较基因组学研究。结果与结论 通过全基因组测序发现S2基因组大小为3 331 982 bp,预测基因有3 243个,GC含量为57.23 %。S2预测基因中大多数基因功能主要与糖代谢﹑氨基酸代谢﹑氨基酸转运和膜转运有关。通过比较基因组学研究发现S2有20个特有基因。另外S2与GenBank公布的S2序列进行比对发现有19个差异基因。     

布鲁氏菌A19疫苗株全基因组测序及比较基因组学分析

目的 探索布鲁氏杆菌A19疫苗株全基因组的结构、分子生物学的功能,并对其生物信息学进行研究。方法 采用Illumina Hiseq 4000和PacBio对A19进行全基因组测序,并与GenBank 上的8株菌进行比较基因组学解析。A19基因组3 286 167 bp, 预测3 371个基因,GC含量57.25%。通过注释COG库,对应基因有2 560个,将其归入22类COG中;根据比对KEGG库,得到2 544个基因,共参与33类代谢通路。结果 综合两个数据库结果发现,大多数A19预测基因中的基因功能主要与膜运输、氨基酸转运及碳水化合物代谢有关。结论 通过分析发现, A19和猪羊牛种布鲁氏菌之间存在一定差异,并找出牛种毒力基因。本实验通过测序A19全基因组,为布鲁菌疫苗的研究提供思路。     

一株神经外低毒力乙型脑炎病毒株的全基因序列分析

目的探究1株新分离的基因Ⅰ型乙脑病毒株的分子生物学特征及其低毒力的分子基础。方法对病毒株扩增,提取其RNA,逆转录PCR后测序,序列与来自世界不同地区不同基因型的野毒株进行同源性比较,并与强毒P3株进行氨基酸位点比对。结果SC04-17在核苷酸和氨基酸序列上,存在与其他基因型毒株不同的特点,与世界各地毒株核苷酸差异率为1.8%～16.5%,氨基酸差异率为0.8%～5.0%;与减毒活疫苗株SA14-14-2的核苷酸、氨基酸同源性分别为88.5%和97.6%,与灭活疫苗株P3核苷酸、氨基酸同源性分别为88.8%和97.9%;与P3强毒株比对,发现72个氨基酸位点差异,分布在全基因的各个区域（E、NS5、NS1和NS3区）。结论SC04-17株的基因序列存在一些独特位点,这些位点的氨基酸变化可能与其低毒力特征有关。     

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方-法的建立

目的 建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方-法。方法 分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行 Realtime-PCR扩增,评价该方-法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方-法的敏感性。结果 本方-法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10² copies/μL和10³ copies/μL。该方-法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论 本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方-法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。     

河南省8株狂犬病毒磷蛋白基质蛋白基因分析

目的分析河南省8株狂犬病毒磷蛋白P及基质蛋白M的基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性变异的可能原因。方法以免疫荧光法检测2006年采自河南省的121份犬脑,取阳性犬脑组织悬液接种鼠脑分离病毒,以RT-nest-edPCR法扩增病毒P与M基因,克隆测序后进行生物信息学分析。结果分离到8株狂犬病毒,序列分析表明8株病毒均为基因1型狂犬病毒,8株病毒彼此之间P基因与M基因核苷酸序列同源性均为98.9%～99.8%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%～99.3%和97.0%～99.5%。8株病毒与我国宁夏分离株CNX8511、CNX8601的同源性最高,P基因与M基因核苷酸同源性分别为89.1%～89.7%和91.1%～92.0%,氨基酸同源性分别为93.3%～94.3%和96.6%～98.0%。在核苷酸及氨基酸水平上,8株病毒与CTN疫苗株的P与M同源性均明显高于与其它疫苗株的相应同源性。系统发育分析表明,8株病毒与我国宁夏街毒株、CTN疫苗株、泰国及菲律宾等东南亚株进化关系最近,而与CTN以外的其它疫苗株、标准攻击毒CVS株,以及我国80年代初分离的DRV、MRV株进化关系较远。氨基酸对位分析表明,较之参比的其它基因1型毒株,河南省8株狂犬病毒的P与M出现多处变异。结论8株狂犬病毒仍属基因1型狂犬病毒,但其P基因及M基因在核苷酸及推导的氨基酸水平上均出现了明显变异。     

Comparison of the virulent Asibi strain of yellow fever virus with the 17D vaccine strain derived from it.

We have sequenced the virulent Asibi strain of yellow fever virus and compared this sequence to that of the 17D vaccine strain, which was derived from it. These two strains of viruses differ by more than 240 passages. We found that the two RNAs, 10,862 nucleotides long, differ at 68 nucleotide positions; these changes result in 32 amino acid differences. Overall, this corresponds to 0.63% nucleotide sequence divergence, and the changes are scattered throughout the genome. The overall divergence at the level of amino acid substitution is 0.94%, but these changes are not randomly distributed among the virus protein. The capsid protein is unchanged, while proteins NS1, NS3, and NS5 contain 0.5% amino acid substitutions, and proteins ns4a and ns4b average 0.8% substitutions. In contrast, proteins ns2a and ns2b have 3.0 and 2.3% amino acid divergence, respectively. The envelope protein also has a relatively high rate of amino acid change of 2.4% (a total of 12 amino acid substitutions). The large number of changes in ns2a and ns2b, which are largely conservative in nature, may result from lowered selective pressure against alteration in this region; among flaviviruses, these polypeptides are much less highly conserved than NS1, NS3, and NS5. However, many of the amino acid substitutions in the E protein are not conservative. It seems likely that at least some of the difference in virulence between the two strains of yellow fever virus results from changes in the envelope protein that affect virus binding to host receptors. Such differences in receptor binding could result in the reduced neurotropism and vicerotropism exhibited by the vaccine strain.     

马鹿布氏杆菌25kDa外膜蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆马鹿布氏杆菌ML分离株25kDa外膜蛋白(Omp25)基因,并在大肠杆菌中表达。方法运用RT-PCR技术从马鹿布氏杆菌分离株中扩增出Omp25基因,将其克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定和遗传变异分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。结果该基因全长642bp,编码213个氨基酸;其中前23个氨基酸残基构成信号肽。在推导的氨基酸序列中,存在两个跨膜区,但没有潜在的N-联糖基化位点。与GenBank中已经登录的布氏杆菌其他11个分离株相比,马鹿布氏杆菌分离株Omp25基因变异较小,以散在的点突变为主,Omp25基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.1%-99.4%和99.2%-99.5%之间。转化重组质粒pETOMP25的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出具有反应原性的目的蛋白,表达量占菌体蛋白的18.6%。结论马鹿布氏杆菌分离株与流产型布氏杆菌其它分离株Omp25基因同源性很高,可能是一个毒力较强的野毒株。