靶向C基因的shRNA抗乙型肝炎病毒在BHK-21细胞中的复制与表达

目的 研究靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的shRNA(shRNA)诱导RNAi(RNAi)在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果.方法 根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组(基因型B属ayw1亚型)已在GenBank登录注册:CYN/2002和CYN/2000(GenBank登录号AY517488,AY517489,等),为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B(-),设计并构建两个靶向同源(CYN/2002和CYN/2000)毒株HBV C基因的长24核苷酸(nt)的shRNA表达质粒(S1和S2),随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的 shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞.首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(EGFP)表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)进一步检验了shRNA抗病毒效果.结果 通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组、S1+S2的共转染组使EGFP的表达水平降低了90%,而对照质粒S3或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达水平,差异有统计学意义(P＜0.01);应用RT-PCR检测C基因mRNA和EGFP基因mRNA的表达量,结果与BH-2型荧光显微镜和FACS-440型流式细胞仪检测结果相吻合,差异有统计学意义(P＜0.01).进一步证实了RNAi抗病毒效果,抗病毒效应持续时间超过48 h.结果 发现,创建的靶向C基因的shRNA能够有效特异地抗C-EGFP基因在BHK-21细胞中的复制与表达.结论 靶向C基因的RNAi技术能够有效特异地抗HBV在BHK-21细胞中的复制与表达.RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV安全有效的应急疫苗.     

ALR基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达的抑制

目的：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法：针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001）,同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论：成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。     

乙酰肝素酶基因靶向特异性RNA干扰重组表达载体的构建及筛选

目的 构建对人乙酰肝素酶(HPA)基因有特异性抑制作用的短发夹状RNA表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的人HPA基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染人MDA-MB-231细胞,分别以荧光定量PCR、Western blot分析其对HPA在mRNA水平和蛋白质水平上表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.在构建的5个载体中,HPSE-1组及HPSE-5组中MDA-MB-231细胞HPA基因mRNA和蛋白质表达水平明显下降,而对照组未发生明显改变.结论 成功构建了2个靶向人HPA的shRNA表达载体,转染MDA-MB-231细胞后可高效抑制HPA基因表达,为进一步研究HPA的表达与乳腺癌迁移和侵袭的机制奠定了基础.     

乙型肝炎病毒C区蛋白在肝癌细胞株中的表达

用PCR法获得编码乙型肝炎病毒C区不同蛋白的基因，利用基因重组技术构建表达这些蛋白的真核表达载体。并在高分化肝癌细胞株HepG2中进行了稳定表达。     

乙型肝炎病毒C区蛋白在肝癌细胞株中的表达

用PCR法获得编码乙型肝炎病毒C区不同蛋白的基因,利用基因重组技术构建表达这些蛋白的真核表达载体,并在高分化肝癌细胞株HepG2中进行了稳定表达。     

原发性肝癌中乙型肝炎病毒的DNA和RNA

研究人员Paterlini等报告,使用多聚酶链反应检测乙肝表面抗原(HBsAg)阴性患者的原发性肝癌内乙型肝炎病毒(HBV)的DNA和RNA序列。用于检测丙型肝炎病毒(HCV)的8份标本中有2份抗体阳性。作者     

靶向Nrf2基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的：利用pSUPER载体构建针对人核因子E2 p45相关因子2（Nrf2）基因的RNA干扰真核表达载体，为研究Nrf2基因在结肠癌化学预防中的作用奠定实验基础。方法：设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列，构建重组载体pSUPER Nrf2转染人结肠癌HT 29细胞。同时转染pEGFP N1质粒，通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光监测转染效率，共转染pEGFP N1 48h后G418筛选稳定表达的细胞。RT PCR和Western blot检测瞬时及稳定转染细胞Nrf2基因的表达，观察稳定筛选出的细胞中UGT1A基因mRNA水平的表达变化。结果：成功构建RNA干扰真核表达载体pSUPER Nrf2。转染后24～96?h，荧光显微镜及FCM检测显示转染效率为30％～75％。瞬时转染pSUPER Nrf2 A2，pSUPER Nrf2 B2重组质粒Nrf2 mRNA的表达差异无显著性（P>0.05）；瞬时转染72?h及稳定转染后，pSUPER Nrf2 A1，pSUPER Nrf2 B1可显著抑制Nrf2基因的表达。RT PCR检测显示，稳定筛选出的细胞中UGT1A表达水平降低（P<0.05）。结论：成功构建了Nrf2的RNA干扰表达载体，筛选并获得低表达Nrf2基因的稳定克隆，筛选出的细胞UGT1A表达水平明显降低，表明Nrf2可能对UGT1A酶的表达具有调节作用。     

CXCR4基因RNA干扰对人肝癌细胞系SMMC7721体外粘附、迁移的影响

目的研究CXCR4基因RNA干扰对肝癌细胞系SMMC7721体外增殖、粘附能力的影响。方法psiR—NA．CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞,Trans well法检测细胞的体外迁移能力,12（;5检测细胞的粘附能力。结果psiRNA-CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞后,明显沉默了SMMC7721mRNA表达,转染后48h抑制效率最高。SMMC7721细胞体外增殖、迁移能力受到抑制（P〈0．05）。结论CXCR4基因RNA干扰在体外可明显沉默肝癌细胞系SMMC7721CXCR4基因的表达,抑制肝癌细胞系SMMC7721的生长和转移。     

Rictor基因特异性RNA干扰表达载体的构建和筛选

目的构建针对Rictor基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人膀胱癌T24细胞,观察其对目的基因Rictor表达的影响,为探讨沉默Rictor基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响奠定基础。方法根据GENEBANK提供Rictor基因系列,设计并化学合成三对Rictor-RNAi和一对阴性对照寡核苷酸序列,定向克隆入真核质粒载体pGCSIL-PUR中,构建pGCSIL-RICTOR-RNAi表达载体。各质粒载体瞬时转染到T24细胞,Western-Blot检测筛选载体。筛选出的载体稳定转染,Realtime-PCR和Western-Blot筛选干扰效果明显的稳定株。结果重组质粒pGCSIL-RICTOR-RNAi经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,成功构建Rictor-RNAi载体。瞬时转染T24细胞,RICTOR蛋白表达明显降低。稳定转染T24细胞,Rictor基因表达在mRNA水平和蛋白水平均明显降低。结论成功构建Rictor-RNAi表达载体,转染T24细胞后可有效抑制Rictor表达。     

靶向人端粒酶小干扰RNA对人喉癌Hep-2细胞系形态学影响

目的探讨靶向人端粒酶基因siRNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞形态学的影响。方法根据人端粒酶基因设计和合成人端粒酶siRNA和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep-2细胞,观察形态学结构。结果转染siRNA48h后细胞皱缩、变圆并开始脱落。HE染色显示细胞呈明显的良性转化。透射电镜下可见细胞凋亡、胀亡的形态改变。结论靶向人端粒酶基因的siRNA能促使Hep-2细胞形态呈良性转化,并能促进肿瘤细胞凋亡。     

EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达和乙型肝炎病毒X蛋白对其表达的影响

目的：探讨肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对EpCAM和CD13表达的影响.方法：Western blot检测正常肝细胞系（LO2细胞）和肝癌细胞系（Huh7,Bel-7404,Hep3B,QSG-7701细胞）中肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13的表达情况,同时建立稳定转染HBx基因的Bel-7404 （Bel-7404/HBx）细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测转染后EpCAM和CD13表达情况.结果：EpCAM和CD13在不同的肝癌细胞系中表达水平完全不同;转染HBx基因后EpCAM的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的（2.04±0.16）和（2.03±0.25）倍;而CD13的mRNA和蛋白表达水平明显下调,分别为对照组的（69±8）％和（55±7）％.结论：肝癌干细胞可能存在多个干细胞亚群,在不同的肝癌细胞中干细胞标记物的表达水平不同,而HBX对不同亚群的影响也不同.     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。     

慢性肝病患者乙型肝炎病毒C基因启动子变异对病毒复制水平及肝功能损害的影响

目的 :探讨乙型肝炎病毒慢性感染 C基因启动子 (BCP)变异对病毒复制水平及肝功能损害程度的影响。方法 :采用PCR微板核酸杂交结合 EL ISA检测显示技术 ,检测 74例乙型肝炎病毒慢性感染者 BCP区核苷酸 (nt) 176 2碱基 A→ T和176 4碱基 G→ A联合突变。结果 :在 74例乙型肝炎病毒慢性感染者中检出 BCP区 T176 2 A 176 4突变 2 4例 (32 .4 % ) ,BCP变异阳性组的 HBVDNA水平 (10 8.2 992± 0 .86 6 5拷贝 / m l)显著高于 BCP变异阴性组的水平 (10 7.1 737± 1 .1 539拷贝 / ml) (P <0 .0 0 1) ;BCP变异组的肝功能损害程度较非变异组明显。结论 :BCP变异可引起 HBV致病力增强 ,复制水平提高 ,变异者的肝功能损害程度较重     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.方法 构建针对人肝癌HepG2细胞 survivin基因3个不同靶序列的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin 基因mRNA表达水平.选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后, 免疫细胞化学法(ICC)检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况.结果 与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性(F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05),而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性(q=0.631～0.126,P>0.05).转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01),其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、 12.601,P<0.01).结论 构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖.     

RNA干扰靶向沉默HER2/neu基因对卵巢癌细胞株SK-OV-3的影响

目的：观察siRNA表达质粒稳定转染靶向沉默HER2/neu基因对SK OV 3卵巢癌细胞株的影响。方法：针对HER2/neu基因序列构建短发夹状siRNA真核表达载体(pGenesil 1 HER2/neu),转染卵巢癌细胞株SK OV 3,G418筛选出稳定转染株后,采用RT PCR和Western Blot法观察HER2/neu基因的沉默效果;CCK 8比色分析检测细胞体外增殖活力;流式细胞仪检测细胞周期。结果：测序证实成功构建HER2/neu的2个短发夹状siRNA真核表达质粒;稳定转染SK OV 3细胞后,转染了特异性HER 2/neu siRNA的细胞HER 2/neu mRNA及p185蛋白水平均明显低于亲本细胞及转染无义对照序列的细胞;CCK 8比色分析显示HER 2/neu基因沉默的细胞存活分数明显低于HER 2/neu基因高表达的细胞（P=0.000）;流式细胞仪细胞周期分析也显示,HER 2/neu基因沉默的细胞处于凋亡状态及非增殖期的比例明显增加（P均<0.01）,而处于合成期的比例却显著减少（P≤0.001）。结论：靶向HER2/neu基因的短发夹状siRNA可从转录及翻译水平有效地沉默HER 2/neu基因;HER 2/neu基因沉默的SK OV 3卵巢癌细胞增殖明显受抑制。     

靶向Cyclin D1基因RNA干扰对肝癌细胞增殖和Mdm2等基因表达影响的研究

目的 探讨Cyclin D1表达下调对Mdm2等基因表达及人肝癌细胞增殖的影响.方法 用脂质体将Cyclin D1-siRNA转染人肝癌细胞株Hep3B细胞.实验分为空白对照组、阴性对照siRNA组、Cyclin D1-siRNA组.采用RT-PCR和Western blot检测Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53和P21表达,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡.结果 与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,Cyclin D1-siRNA组P53和P21表达上调(P＜0.05),Cyclin D1、Mdm2和Mdm4表达下调(P＜0.01);3组细胞周期G1、S及G2期均无明显差异(P＞0.05);Cyclin D1-siRNA组较其他两组细胞活力明显减弱(P＜0.01),细胞凋亡明显增强(P＜0.01).结论 Cyclin D1表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达,并能上调P53和P21的表达;Cyclin D1表达下调能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡.     

靶向c-myc基因小RNA干扰对胆囊癌细胞侵袭运动的影响

目的 研究c-myc基因在胆囊癌侵袭和转移中的作用及其机制。方法 采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测亲代和高转移胆囊癌细胞系中c-myc基因表达,设计靶向c-myc的干扰性小RNA(siRNA)转染高转移的胆囊癌细胞,体外Transwell实验研究c-myc siRNA对胆囊癌高转移细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质印迹法检测转染c-myc siRNA后c-myc下游部分信号通路的变化。结果 高转移细胞中c-myc基因表达高于亲代细胞,转染c-myc siRNA后,c-myc的表达在转录和翻译水平均降低。同时GBC-SD/M3细胞的转移和侵袭能力受到抑制。对c-myc下游信号通路的检测发现LIN28的表达下调。结论 c-myc在高转移的胆囊癌细胞中表达上调;通过siRNA下调其表达后可以抑制胆囊癌细胞的转移和侵袭,这种抑制作用可能与LIN28的下调有关。