实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的临床应用价值。方法经培养鉴定的70例已知细菌中22例为MRSA,48例为非MRSA,对已知细菌用实时荧光定量PCR进行检测,了解该方法的特异性和敏感性。对临床88例医护人员和患者的鼻拭子进行实时荧光定量PCR检测,了解医院内MRSA的携带情况。结果培养为MRSA,实时荧光定量PCR检测结果均为MRSA,敏感性为100%;培养为非MRSA,实时荧光定量PCR检测结果均为非MRSA,特异性为100%。实时荧光定量PCR检测MRSA的敏感性可确定为1×103cfu/mL。48例患者的鼻拭子mecA耐药基因阳性26例,金黄色葡萄球菌阳性28例,两者同时阳性(即为MRSA)20例,MRSA阳性检出率为41.6%;40例医护人员鼻拭子mecA耐药基因阳性12例,金黄色葡萄球菌阳性13例,两者同时阳性(即为MRSA)9例,MRSA阳性检出率为22.5%。结论实时荧光定量PCR可用于临床对MRSA的快速检测。     

实时荧光PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的临床评估

目的:采用实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),并评价该方法在临床上的应用价值。方法:将临床分离的62株金黄色葡萄球菌(金葡菌)和35株非金黄色葡萄球菌同时采用分离培养及药物敏感试验(药敏试验)和实时荧光PCR法进行检测并比较,对2种方法检测结果不符的菌株辅以测序法进行最后鉴定,并确定实时荧光PCR法的检测灵敏度。结果:分离培养法与实时荧光PCR法对金葡菌检测的一致率为100%,都检测出了62株金葡菌阳性株。实时荧光PCR法与分离培养药敏试验法MRSA检测的符合率为96.77%,而分离培养药敏试验法检测为阴性而实时荧光PCR法检测为阳性的2株待检菌的测序结果显示为MRSA阳性株。最后确定实时荧光PCR法检测MRSA的临床灵敏度为1×103 cfu/mL。结论:实时荧光PCR法可用于临床对MRSA的快速检测,具有较高的临床价值。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MecA基因的实时荧光定量PCR方法学评价

目的评估实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测临床标本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)MecA耐药基因的价值。方法选择该院2013年6~12月125份临床标本,包括血液40份,痰液52份,创面分泌物33份进行FQ-PCR检测和细菌鉴定,分析结果符合率,以检测FQ-PCR的灵敏度及特异性。结果FQ-PCR的灵敏度为0.159pg/μL,检测经细菌培养鉴定的菌株,特异性达到100%,与临床标本结果符合率为97.6%。结论 FQ-PCR检测MRSA的MecA基因更加方便、快速,且灵敏度和特异性等性能指标均比较理想,与细菌鉴定结果符合率较高,适合临床广泛应用。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的建立和评价

目的建立实时荧光PCR快速筛查耐甲氧西林葡萄球菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株的方法。方法以耐甲氧西林mecA基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中耐甲氧西林葡萄球菌的实时荧光PCR方法,结合对金黄色葡萄球菌的特异性NUC基因进行实时荧光检测,可鉴定是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。以纸片扩散法作为对照方法,对所建立的实时荧光PCR检测方法检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法的整个检测过程只需要1.5h;对22例临床样本进行检测,所建立的荧光PCR方法比纸片法多检出2例耐甲氧西林菌株;对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测结果一致。结论本研究建立的实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法不仅能实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测,更可能为指导临床用药提供有价值的参考。     

聚合酶链反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因

建立聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ．ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）ｍｅｃＡ基因的技术。四种ＤＮＡ提取方法检测灵敏度依次为超声裂解法（５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）、溶菌酶表面活性剂法（５×１０６ＣＦＵ／ｍｌ），表面活性剂法（１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）和直接煮沸法（１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ），直接煮沸法具有简便性。引物的正链位于１８１～２００、负链位于３１１～３３０，序列分别为５＇－ＧＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＴ，５＇－ＧＣＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＧＴ，其扩增产物长度为１５０ｂｐ。五种常见菌证明本法具有较高特异性。苯唑青霉素ＭＩＣ水平与ｍｅｃＡ基因之间具有很好的相关性，ＭＩＣ≥４μｇ／ｍｌ的２２株菌均检出ｍｅｃＡ基因，提示苯唑青霉素常规检测ＭＲＳＡ的可行性。ＰＣＲ方法对于隐匿型耐药株的检出具有重要价值。     

快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的应用评价

快速、准确地筛选高危病人成为医院有效控制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (ＭＲＳＡ)的关键。目前 ,临床上对ｍａｃＡ基因以及其编码ＰＢＰ2ａ进行检测是最有效的方法。我们将ＰＢＰ2ａ胶乳法和ｍｅｃＡ基因探针法与ＰＣＲ检测法进行了比较 ,并评价了它们的可靠性和临床应用价值 ,报道如下。一、材料与方法1 菌株 :采用ＡＰＩ系统试条鉴定为金黄色葡萄球菌 ,共96株。分别选ＡＴＣＣ4330 0、ＡＴＣＣ2 5 92 3为阳性和阴性质控菌。2 ＭＲＳＡ筛选 :按标准制备菌悬液 ,接种于苯唑西林琼脂筛选平板上 ;35℃ ,2 4ｈ孵育 ,有菌落生长为ＭＲＳＡ。3 …     

多重PCR直接鉴定临床标本中的耐甲氧西林葡萄球菌

目的：应用多重PCR直接鉴定临床标本中的耐甲氧西林葡萄球菌（MRS），利于迅速的诊断和治疗。方法：采用QiaAmpDNABlood MiniKit，从血培养瓶、尿液、穿刺液的肉汤增菌液、脓汁、痰、阴道及子宫颈分泌物直接迅速提取制备模板DNA：通过多重PCR技术扩增标本的meca基因和葡萄球菌16SrRNA基因。结果：287例葡萄球菌感染的临床标本中，金黄色葡萄球菌的meca基因阳性率为54．4％（55／101），凝固酶阴性葡萄球菌meca基因阳性率为58．6％（109／186）。从模板DNA制备到多重PCR产物的检测不到4h。结论：建立的基于DNA分离和多重PCR检测MRS的技术具有敏感、快速、特异的特点，是一种可靠的实验诊断手段。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其检测方法

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以其多重耐药率高,致病性强,常引起院内感染的暴发流行等特性,已引起世界范围的广泛重视,寻找一种简便、快速、准确的检测方法,对于控制院内感染,积极救治患者有重要意义。本文概述了MRSA的一些特性以及近年来检测MRSA的方法,可望有助于充分认识MRSA以及选择准确检测MRSA的方法。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA提取方法的改进

目的研究适用于PCR法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的核酸提取方法。方法 MRSA在不同孵育条件下分别经含溶菌酶、溶葡萄球菌酶或chelex100R的裂解液裂解获得DNA,用PCR法检测目的基因。结果同时使用溶菌酶、溶葡萄球菌酶、chelex100R裂解得到的DNA,在用PCR法检测mecA基因时,获得的循环阈值(Ct值)明显低于其他组分的裂解液。采用56℃一步法孵育裂解细菌的效果,与37、56℃二步法比较,差异无统计学意义(P0.05),但简化了步骤。结论含溶菌酶、溶葡萄球菌酶、chelex100R等的裂解液同时与细菌于56℃孵育30min的方法,是获取MRSA细菌DNA既便捷又高效的方法,可以立即用于下一步PCR,为PCR法快速检测临床MRSA感染奠定了基础。     

多重荧光定量PCR法快速鉴定MRSA的临床研究

目的 构建mecA、nuc、内标基因3种基因联合检测的单管多通道Taqman探针荧光定量PCR法,用于鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),并与传统细菌培养和鉴定方法进行比较,评估其临床应用价值.方法 以169例临床标本和经常规细菌培养和VITEK2 Compact全自动微生物分析仪鉴定的金黄色葡萄球菌(SA)15...     

实时荧光定量PCR检测HBV-DNA测量不确定度的评定

目的探讨实验室实时荧光定量PCR检测HBV-DNA测量不确定度的评定方法,并对其临床应用进行分析评价。方法依据CNAS-TRL-001:2012《医学实验室——测量不确定度的评定与表达》,以室内质量控制评定实验室测量复现性,以有证参考物质(CRM)评定偏倚,以测量复现性和偏倚评定测量不确定度。结果高、中、低值扩展不确定度(k=2)分别为0.99、1.14、0.94(对数值),相对扩展不确定度(k=2)分别为9.15%、24.7%、31.1%。结论以复现性和偏倚评定HBV-DNA测量不确定度方法有效可行,适合实验室测量不确定度的评定,适合实验室之间测量不确定度的比较分析。     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。     

Comparative evaluation of a rapid MRSA detection assay based on multiplex real-time PCR versus MRSA screening cultures containing egg yolk

Although the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) has been recommending the performance of active surveillance culture (ASC) for the prevention of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections and their control since the guideline was issued in 2006, many variant types of MRSA with various characteristics have been found recently. As this change in MRSA characteristics makes it harder to screen MRSA only by cultures, it is expected that ASC will not be sufficient for the prevention of MRSA infections or MRSA infection control. We evaluated the comparative utility of the BD GeneOhm MRSA assay (a rapid MRSA detection test based on a multiplex real-time polymerase chain reaction [PCR] assay; Becton Dickinson, Fukushima, Japan) and MRSA screening cultures containing egg yolk. The results of the BD GeneOhm MRSA assay were as follows: all MRSA strains were positive, including one strain which became positive by retest; all methicillin-resistant S. epidermidis (MRSE) strains and methicillin-sensitive S. epidermidis (MSSE) strains were negative; 11 of 12 methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) strains were negative, while 1 strain was positive; ATCC 33591 was positive, and ATCC 29213 was negative. The sensitivity and specificity of the BD GeneOhm MRSA assay were 100% and 97.4%, respectively. Nine egg yolk reaction-negative MRSA strains were found in 50 MRSA strains, and all MRSE, MSSA, and MSSE strains were denied as MRSA on Pourmedia MRSA II (Eiken Chemical, Tokyo, Japan) after 24-h or 48-h incubation at 35°C. The sensitivity and specificity of Pourmedia MRSA II were 82% and 100%, respectively. Similar results were obtained with some other cultures containing egg yolk.     

利用实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测鸭沙门菌

目的为快速检测、鉴定鸭沙门菌，避免血清型误判，提高鸭沙门菌暴发应对能力，建立一种实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测方法。方法随机挑选60株鸭沙门菌及238株肠道常见病原菌代表菌株，针对鸭沙门菌血清型特异基因AW58_15605设计引物并建立qPCR检测体系，通过纯菌菌株、模拟粪便样本及临床样本评价该体系的特异度、灵敏度及检测下限。结果60株鸭沙门菌株及临床感染的50份样本扩增结果均为阳性，而对鸭沙门菌血清型以外的其他沙门菌及肠道菌的扩增均为阴性。 对鸭沙门菌纯菌DNA的最低检测下限为8拷贝/反应。 粪便模拟样本检测中，增菌后qPCR检测下限达59.10 cfu/g，明显低于分离培养及增菌前。结论本研究建立的基于特异基因的鸭沙门菌分子检测方法具有可操作性强、特异度高、灵敏度高的特点，建议在应急情况下优先选择qPCR用于沙门菌暴发筛查、鉴别及诊断由其引起的腹泻性疾病。     

实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的应用评价

目的探讨实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌核酸DNA浓度的检测范围和检测健康人全血中核酸DNA的Ct本底值。方法采用试剂盒提取纯菌、健康人和临床患者血液中的核酸DNA,应用实时荧光定量PCR进行检测。结果经检测,40份健康人群血液标本Ct值平均值为37.0,标准差为1.9,Ct值95%置信区间为33.0~38.8。将布鲁氏菌核酸DNA标准品倍比稀释(56.2 ng^0.026 5 fg),实时荧光定量PCR检测灵敏度为6.7fg。结论实时荧光定量PCR检测纯菌核酸DNA的灵敏度相当于2个基因组DNA拷贝数,但用于检测血液标本尚待进一步研究。     

HBV—DNA荧光定量PCR检测下限的确立

目的 确立本实验室荧光定量PCR检测HBV-DNA项目的检测下限.方法 分别测定原倍HBV-DNA质控血清及经100、200倍稀释后HBV-DNA含量.结果 原倍质控血清测定结果的均值为3.63×104 IU/mL（4.56）,在给定靶值范围2.14×104～2.14×105 IU/mL（4.33～5.33）的低值附近;100倍稀释后的检测结果的均值为3.32 × 102 IU/mL（2.52）,在试剂盒最低检测下限（500 IU/mL）以下,且100份标本能100%定量检测.结论 本实验室设备及所用的试剂、方法对HBV-DNA〉500 IU/mL的标本完全有能力定量检测;检测下限为500 IU/mL是符合要求的.     

ABI 7300实时荧光定量PCR仪的性能评估

目的为参加医学实验室认可和评价仪器性能,对ABI 7300实时荧光定量PCR仪的性能进行评估。方法参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)文件对ABI 7300荧光定量PCR仪检测HBV-DNA定量结果的精密度、正确度、灵敏度及线性进行评价。结果精密度:批内变异系数(CV批内)为2.38%~4.61%,批间变异系数(CV批间)为3.87%~5.33%,达到《医学实验室质量和能力认可准则》中基因扩增检验项目分析性能标准(CV批内4.8%,CV批间6.4%)。正确度:参加2011年卫生部室间质评结果总体平均偏倚为2.14%,符合卫生部质评要求(偏倚不超过8%);功能灵敏度:100IU/mL检测限浓度的CV值最接近于20%,与试剂盒检出下限相符;线性:相关系数(r2)为1.0,线性关系符合要求。结论 ABI 7300实时荧光定量PCR仪各项性能指标精确,可以为临床提供快速、准确的报告。