纳米支架与犬骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的研究具有纳米结构二嵌段共聚物左旋聚乳酸-聚己内酯（PLLA-b-PCL）与犬骨髓基质干细胞（BMSCs）的体外生物相容性，探讨其作为软骨组织工程支架的可行性。方法开环聚合制备PLLA-b—PCL，液-液相分离制备PLLA-b-PCL纳米支架，扫描电镜观察材料结构。分离培养犬BMSCs，取第3代BMSCs接种于PLLA-b—PCL膜进行复合二维培养，MTT法检测细胞毒性；通过倒置显微镜、Hoechst33342荧光法观察细胞的形态与黏附情况。另取第3代BMSCs与纳米PLLA—b-PCL支架材料（实验组）、PLLA—b—PCL支架材料（对照组）进行三维培养3周，扫描电镜观察BMSCs的形态、黏附、生长情况，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量，BCA法测定蛋白质含量。结果PLLA-b-PCL无细胞毒性，BMSCs在纳米PLLA—b—PCL支架上黏附、增殖良好。随时间延长，BMSCs在支架材料上的DNA和蛋白质含量逐渐增加，DNA和蛋白质含量均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论PLLA-b—PCL纳米支架能为BMSCs的生长分化提供较好的环境，具有良好的生物相容性，有望成为一种较好的软骨组织工程支架材料。     

Hoechst33342标记大鼠骨髓间充质干细胞及其在大鼠体内的迁移

目的 检测外源性的BMSCs是否可向骨缺损处迁移,Hoechest3342标记BMSCs,从而跟踪外源性BMSCs在体内的迁移,研究其归巢机制可行性.方法 贴壁筛选提取大鼠BMSCs,培养至第三代,用Hoechst33342标记后,尾静脉回植于颅骨缺损的大鼠体内,14d后处死大鼠,取颅骨,切片,荧光显微镜下观察细胞迁移情况.主要观察指标:光学显微镜下观察不同时期细胞形态和表面抗原检测;荧光显微镜下观察Hoechst33342标记后细胞形态,以及细胞增殖率;组织切片上Hoechst33342标记的阳性细胞.结果 筛选纯化的BMSCs呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主.CD45阴性,CD44、CD90均呈阳性表达;组织切片上可见Hoechst33342标记大鼠的BMSCs.结论 外源性的BMSCs可向骨缺损处迁移;Hoechst33342可以标记BMSCs,从而跟踪外源性BMSCs在体内的迁移,进而研究其归巢机制.     

转化生长因子-β基因转染骨髓基质干细胞在多肽修饰的聚乳酸-羟基乙酸上生长情况的研究

目的 探讨转转化生长因子-β(TGF-β)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)在RGD多肽表面修饰的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)材料上的增殖、黏附、分化情况,以研究TGF-β基因和RGD多肽在调控种子细胞生物学行为方面的作用. 方法将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,把TGF-β基因转入BMSCs,以单纯PLGA支架材料、单纯BMSCs作为对照,分别将单纯BMSCs和转TGF-β基因BMSCs两组细胞种植于两种材料上,培养1、2、3 d后,计数细胞密度以反映细胞增殖情况:接种后4、12 h,沉淀法定量检测黏附的细胞数;培养24 h后用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色,观察细胞骨架的组织情况;用成骨性培养基培养7、14、21 d,检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性来了解BMSCs分化情况. 结果转TGF-β基因细胞密度显著增大,且在各时间点有较高的ALP活性.RGD多肽修饰的PLGA材料上细胞黏附率高,并有较高的荧光素密度及较粗大的细胞骨架,且在第14天时表现出高的ALP活性.结论 TGF-β基因和RGD多肽同时应用有利于BMSCs黏附到支架材料上,并能促进其增殖和向成骨细胞方向分化.     

不同标记方法对大鼠骨髓间充质干细胞标记的研究

目的 观察Hoechst33342、BrdU、DAPI对大鼠BMSCs标记情况，比较其标记效果的差异性；培养转基因绿色荧光小鼠BMSCs的，观察细胞生长情况和其荧光持续时间，比较其与荧光标记后的干细胞之间的优越性。方法 贴壁筛选提取大鼠BMSCs，培养至第三代，流式细胞仪检测其表面抗原，成骨、成脂诱导后染色；Hoechst33342、BrdU、DAPI标记大鼠BMSCs，检测标记后的大鼠BMSCs增殖率，显微镜下观察其荧光持续时间；观察转基因绿色荧光小鼠BMSCs在培养不同时间段的细胞形态、荧光持续时间以及同上边3种标记方法比较的优缺点。结果 Hoechst33342、BrdU、DAPI可用于对BMSCs的标记；BrdU标记过程较长，在前期不存在荧光猝灭缺点，标记后经过荧光免疫组化处理后可见阳性细胞，Hoechst33342、DAPI标记过程较短，荧光持续时间较长，但此过程中必须避光，对操作带来了一定的困难。3种方法标记后对细胞增殖率无影响；转基因小鼠BMSCs生长较大鼠干细胞生长较慢，其优点是不用标记且荧光持续时间较长，用于细胞追踪研究更为方便可行。结论 干细胞有多向分化的潜能，因此有很好的研究价值和应用价值，对干细胞进行标记，为干细胞迁移、归巢机制的研究提供更好的研究平台。     

成骨细胞特异性钙黏蛋白涂布脱钙骨基质材料对BMSCs黏附及成骨分化能力的影响

目的 探讨成骨细胞特异性钙黏蛋白(cadhefin ectodomain Ⅱ,Cad-Ⅱ)涂布于同种异体脱钙骨基质材料(freeze-dried demineralized bone matrix,FDBM)对兔BMSCs黏附、增殖及成骨分化能力的影响.方法 取4周龄日本大耳白兔10只,体重0.61～0.88 kg,雌雄不限,常规分离培养BMSCs.取第2代BMSCs(细胞密度1×106个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合,行MTT检测细胞增殖能力,细胞黏附实验检测细胞上架率和上架数,倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察细胞生长情况.另取第2代BMSCs(细胞密度5×105个/mL)分别与经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(实验组)和未经Cad-Ⅱ修饰的FDBM(对照组)复合培养,行ALP活性检测和骨钙素免疫组织化学染色观察细胞成骨分化情况.结果 MTT检测发现BMSCs在经Cad-Ⅱ修饰的支架材料上能正常增殖,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).实验组细胞上架率为87.41%±5.19%,明显高于对照组35.56%±0.75%(P<0.01);对照组每片材料细胞上架数平均为2.6×104个,实验组平均高达5.0×105个,明显多于对照组(P<0.05).倒置相差显微镜、扫描电镜及HE染色观察均显示实验组支架上黏附细胞数量明显多于对照组.成骨诱导培养7 d,实验组和对照组细胞均可表达骨钙素,具有成骨细胞表型;培养14 d,实验组和对照组ALP活性分别为29.33±1.53和18.31±1.32,骨钙素免疫组织化学染色阳性率分别为83%±7%和56%±7%,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01);与同组7、21 d比较差异有统计学意义(P<0.01),7 d与21 d组间及组内比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 Cad-Ⅱ修饰的FDBM对BMSCs增殖无明显促进作用,但能提高细胞黏附性,并促进BMSCs向成骨细胞分化.     

BMSCs复合胶原材料三维诱导软骨细胞的初步研究

目的 通过体外培养犬BMSCs,以胶原海绵作为支架材料,体外三维复合培养后,观察向软骨细胞定向诱导的可行性. 方法 健康家犬10只,体重10～15 kg,雌雄不拘.抽取骨髓,体外培养BMSCs,传至第3代,倒置相差显微镜观察细胞形态.实验组将第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于胶原海绵支架材料,体外培养48 h后,将细胞材料复合物以软骨细胞定向诱导培养基进行诱导,每隔2天换液;对照组将第3代BMSCs以相同密度接种于胶原海绵支架材料,每隔2天以DMEM换液.培养后14 d,将细胞材料复合物行HE染色和免疫组织化学染色观察. 结果 倒置相差显微镜下第3代BMSCs与第2代BMSCs形态基本一致,传代初期细胞伸出伪足,呈梭形或三角形,7 d后逐渐以梭形为主,胞体饱满,细胞传代后增长速度明显加快.组织学观察实验组细胞广泛分布于支架材料孔隙内,多数细胞呈多角形或者不规则形,少数呈短梭形,细胞周围间隙可见基质成分;对照组细胞分布于支架材料孔隙内,呈梭形或圆形,核呈圆形或椭圆形,胞体较大,胞质透亮均匀,细胞核轮廓清楚,呈蓝色.免疫组织化学染色显示,实验组支架材料孔隙内的细胞胞浆可见棕黄色颗粒,细胞周围出现黄染区;对照组无表达. 结论 BMSCs接种于胶原海绵材料后,经定向软骨诱导后,可向软骨组织方向分化.     

静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸/聚乙二醇纳米纤维作为组织工程支架的体外细胞相容性研究

目的 探讨静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)/聚乙二醇(PEG)共聚物纳米纤维作为组织工程支架的可行性,及其与大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外相容性. 方法 静电纺丝法分别制备PLGA/PEG和PLGA纳米纤维支架,扫描电镜(SEM)观察材料结构;分离培养大鼠BMSCs,取第3代BMSCs分别接种于PLGA/PEG纳米纤维支架和PLGA纳米纤维支架进行培养,噻唑蓝(MTT)法测定其细胞毒性及细胞增殖;接种后2、4、6h血球计数板计数法测定其黏附率;DAPI荧光染色观察细胞核形态;SEM观察细胞和支架的形态、黏附及生长情况. 结果 SEM观察显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构.PLGA/PEG组和PLGA组纤维直径分别为(655±57)nm和(539±48)nm;孔隙率分别为86.8％±1.5％和84.7％±1 2％.MTT检测BMSCs在两组支架中生长良好,OD值均随时间延长而增大,两组各时间点比较差异均有统计学意义(P＜0 05).各时间段PLGA/PEG组的细胞黏附率明显高于PLGA组,差异均有统计学意义(P＜0.05).DAPI染色示各组细胞核形态正常,核质均染,未见明显凋亡及坏死细胞;PLGA/PEG组细胞较PLGA组明显增多.SEM观察显示,PLGA/PEG组BMSCs在支架上生长良好,基质分泌、生长情况优于PLGA组. 结论 采用静电纺丝法制备的PLGA/PEG纳米纤维支架安全无毒,具备合适的孔径和孔隙率,适合BMSCs生长,细胞相容性良好,是一种组织工程良好的支架载体.     

上皮细胞条件培养液对BMSCs分化的影响

目的 探讨上皮细胞条件培养液(epithelial cell conditioned medium,ECCM)体外诱导犬BMSCs向上皮细胞分化的可行性.方法 成年健康雄性比格犬1只,体重10 kg.于犬髂后上棘采用骨髓穿刺法取骨髓5 mL,分离培养BMSCs.取犬口腔黏膜下组织,剪成约4 mm×4 mm大小,制备ECCM.取第2代BMSCs以2×104个/孔细胞密度接种,实验组于ECCM中培养,对照组于低糖DMEM完全培养基中培养.观察两组细胞形态特征,MTT法绘制生长曲线,诱导培养21 d免疫组织化学染色鉴定上皮细胞特异性标志物--细胞角蛋白19(cytokeratinl9,CK-19)和细胞角蛋白AE1/AE3,透射电镜观察细胞超微结构.结果 倒置相差显微镜下见两组细胞均呈长梭形,均匀分布,折光性较强,增殖迅速.两组细胞生长曲线均呈"S"形,实验组生长曲线较对照组右移,提示ECCM对细胞增殖有抑制作用.实验组CK-19和细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色均呈阳性反应,对照组呈阴性.透射电镜下实验组细胞胞浆内可见紧密连接.结论 ECCM体外有诱导同种BMSCs向上皮细胞分化的作用.     

胶原凝胶构建神经组织工程支架的实验研究

目的研究胶原凝胶支架对大鼠BMSCs增殖和分化的影响,探讨其作为神经组织工程支架的可行性。方法利用Ⅰ型胶原制备胶原凝胶支架。采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs,取第5代细胞制备胶原凝胶-BMSCs复合体。采用扫描电镜、HE染色观察胶原凝胶支架的形态结构及复合培养后细胞形态;MTT检测该支架对BMSCs增殖的影响。取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性(GFP~+)BMSCs于胶原凝胶支架中培养24 h,通过激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察细胞生长及与材料的黏附情况。结果激光共聚焦显微镜及活细胞工作站观察示,GFP~+BMSCs均匀分布于胶原凝胶支架内,大部分GFP~+BMSCs呈梭形,部分细胞伸出突起,部分细胞间形成连接,提示BMSCs在三维空间中生长良好。扫描电镜示胶原凝胶支架为多孔纤维网状结构,BMSCs可黏附于该支架材料上,细胞形态良好。MTT检测示,BMSCs于胶原凝胶支架中培养后3、5、7 d的吸光度(A)值均高于单纯BMSCs培养,其中5、7 d时组间差异有统计学意义(t=4.472,P=0.011;t=4.819,P=0.009)。HE染色示,胶原凝胶支架呈均质淡粉染细丝样物质。BMSCs在胶原凝胶内培养24 h后均匀分布其中;7 d时BMSCs形态多样,部分细胞伸出细长突起,具有体外培养的神经元样形态。结论胶原凝胶支架制备简便,具有良好的生物相容性,可作为神经组织工程支架材料。     

纳米结构PCL—b—PLLA材料特性及其与犬软骨细胞的生物相容性研究

目的探讨具有纳米结构的聚己内酯／左旋聚乳酸共聚物（PCL—b—PLIJA）作为半月板组织工程支架的可行性，及其与犬软骨细胞的体外生物相容性。方法开环聚合制备PCL-b-PLLA，液-液相分离技术制备纳米结构PCL—b—PLLA支架，固-液相分离技术制备PCL—b—PLLA支架，扫描电镜（SEM）观察材料结构；测定纳米结构支架体外降解率及力学强度。分离培养犬软骨细胞，取第3代软骨细胞接种于纳米结构PCL—b—PLIA（实验组）、PCL—b—PLLA（对照组）支架材料上进行三维培养6d，SEM观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况；细胞支架复合培养3、6、12d后，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量。结果实验组支架材料相对分子量150kD，压缩强度为72．6KPa，孔隙率为93％。SEM示实验组支架表面为多孔状，孔壁为纤维网状连接。其降解率起初始较慢，8周后降解速率明显加快。软骨细胞在实验组支架上粘附、增殖优于对照组。随时间延长细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加，实验组DNA和蛋白质含量均明显高于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论具有纳米结构的PCL-b—PILA支架具有良好的生物力学性能及可降解性，可显著促进细胞粘附、增殖及合成代谢，有望成为一种较为理想的半月板组织工程支架材料。     

CD44分子岩藻糖基化修饰对兔BMSCs流体黏附力的影响

目的探讨CD44分子岩藻糖基化修饰对兔BMSCs流体黏附力的影响。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养的方法体外分离纯化获得兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞表面MSCs相关抗原CD44、CD34、CD29、CD105的表达。使用α-1,3-岩藻糖转移酶Ⅵ(α-1,3-fucosyltransferaseⅥ,FTⅥ)对兔BMSCs进行体外岩藻糖基化处理作为实验组,以未经岩藻糖基化处理的BMSCs作为对照组,采用流式细胞仪检测唾液酸化Lewis X(sialyl-Lewis X,sLe~X)阳性率及E-选择素结合率。使用Hank平衡盐溶液重悬的岩藻糖基化BMSCs作为实验组(A组),未经岩藻糖基化修饰的BMSCs作为研究对照组(B组),添加EDTA冲洗的岩藻糖基化兔BMSCs作为阴性对照组(C组),利用平行板流室黏附试验检测兔BMSCs流体黏附力。结果兔BMSCs形态以长梭形为主,生长旺盛;第3代BMSCs CD44、CD29、CD105呈阳性表达,而CD34呈阴性表达。实验组sLe~X阳性率为32.52%±1.76%,显著高于对照组的1.48%±0.51%,差异有统计学意义(t=29.277,P=0.000);实验组E-选择素结合率为41.05%±1.84%,显著高于对照组的4.33%±0.92%,差异有统计学意义(t=35.674,P=0.000)。随着流体剪切力的增加,A组人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)表面黏附的BMSCs数量先升高后降低,而B、C组HUVEC表面几乎无BMSCs黏附。各剪切力作用下,A组HUVEC表面黏附的BMSCs细胞数均显著多于B、C组,差异有统计学意义(P0.05),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD44分子岩藻糖基化修饰能够增强兔BMSCs的流体黏附力。     

降钙素基因相关肽促进大鼠BMSCs迁移及VEGF的表达

目的观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在大鼠BMSCs迁移中的作用及对VEGF、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)表达的影响,探讨CGRP通过BMSCs促进血管生成的作用机制。方法全骨髓法分离、培养SD大鼠BMSCs,采用Western blot法于传代培养1、2、3周时检测BMSCs中CGRP受体(CGRP receptor,CGRPR)蛋白的表达。使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP作用于BMSCs作为实验组,单纯BMSCs作为对照组,在培养72 h时采用细胞趋化实验检测CGRP对BMSCs迁移的影响;在培养1、3、5、7 d采用实时荧光定量PCR检测CGRP作用后VCAM-1 mRNA的表达变化,采用免疫细胞化学染色、Western blot法检测CGRP作用后VEGF的表达变化。结果 Western blot检测示BMSCs稳定表达CGRPR,2周时表达最高。细胞趋化实验显示,实验组CGRP刺激后穿膜迁移细胞数(3.20±1.77)个/HP,较对照组(1.11±0.49)个/HP明显增多(t=4.230,P=0.001)。实时荧光定量PCR检测示,实验组VCAM-1 mRNA表达随时间延长逐渐增加,7 d时最高;实验组3、5、7 d的VCAM-1 mRNA表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色示,培养1、3 d两组均无阳性染色;培养5、7 d实验组VEGF染色呈阳性,对照组无阳性染色。Western blot检测示,培养1、3 d两组均未检测到VEGF蛋白表达;培养5、7 d实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);实验组5 d的VEGF蛋白表达量明显高于7 d(P<0.05)。结论 CGRP能促进BMSCs迁移及VEGF表达,这可能是CGRP调节骨内部血流变化而影响骨代谢的机制之一。     

骨形态发生蛋白-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨对骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活件多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖、黏附及分化等生物学行为的影响. 方法制备重组胶原矿化骨支架材料,将BMP-2活性多肽通过交联剂共价结合到材料上,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;取第3代BMSCs接种到材料上,以未结合多肽的重组胶原矿化骨作为对照,采用MTT法检测BMSCs在材料表面的增殖;沉淀法检测BMSCs在材料表面的黏附率;扣描电镜观察比较BMSCs在材料表面的生长形态;通过检测细胞中的碱性磷酸酶活性及钙含量,观察BMSCs在材料表面的分化情况. 结果扫描电镜结果显示:支架材料旱多孔状;X射线光电子能谱法证实BMP-2活性多肽成功共价结合到材料表面;BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料表面BMSCs的黏附和向成骨细胞方向分化能力均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而BMSCs的增殖能力与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论BMP-2活性多肽可以显著改善重组胶原矿化骨复合材料的细胞相容性和生物活性,经BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料是一种理想的骨组织工程支架材料.     

基于快速成形的磷酸钙多孔陶瓷成骨性能初步研究

目的磷酸钙生物材料由于其优良的生物相容性而具有广阔的应用前景,但传统方法难以制备具有复杂形状的支架。以快速成形方法制备磷酸钙多孔陶瓷支架材料,并对其体外成骨性能进行初步研究。方法采用快速成形方法制备磷酸钙多孔陶瓷支架材料(直径10mm、高度5mm、孔径800μm),取Beagle犬髂骨髓分离培养BMSCs,接种第3代BMSCs于支架材料上。将实验分为4组,A组为成骨诱导培养的细胞/材料复合物组,B组为未经成骨诱导培养的细胞/材料复合物组,另设平皿成骨诱导培养及常规培养为阳性对照组(C组)及阴性对照组(D组)。于接种后第1、3、7天,利用DNA定量检测方法及ALP定量、定性检测方法检测BMSCs在支架材料上的增殖及ALP的表达;并经DiO荧光染色后,应用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在材料上的黏附生长情况。结果 DNA定量结果表明,随培养时间增加,C、D组在第3天时细胞生长进入平台期;A、B组细胞呈持续增长趋势,细胞培养过程中增殖速度均略低于C、D组,且未出现明显的平台期。DiO荧光染色示,BMSCs在以快速成形方法制备的磷酸钙多孔陶瓷支架材料上黏附、生长状态良好。ALP染色示,随培养时间延长,A、B组支架上细胞染色均逐渐加深,A组各时间点染色程度均明显强于B组。培养后第1、3天,4组ALP表达均较低,差异无统计学意义(P0.05);培养第7天,各组ALP表达均明显升高,A组比其他各组明显高表达(P0.05),B组及C组均明显高于D组(P0.05)。结论快速成形的多孔磷酸钙陶瓷具有良好的细胞相容性,BMSCs与支架复合在体外诱导培养可以进行成骨分化。因此通过快速成形技术制备的磷酸钙多孔陶瓷是骨组织工程可选的细胞支架。     

骨髓基质干细胞体外复合珊瑚材料的生长和成骨活性

目的 尝试以骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)作为种子细胞,复合珊瑚体外培养,以发现适宜的细胞接种密度以及复合物体外共培养时间.方法 分离犬BMSCs,成骨诱导后复合珊瑚继续培养,以无诱导BMSCs复合物为对照.进行黏附率、生长曲线、扫描电镜、碱性磷酸酶(AKP)和骨钙蛋白(OCN)生物化学定量检测.结果 AKP和OCN检测均显示成骨诱导BMSCs-材料组显著高于无诱导BMSCs-材料组.复合物接种密度超过1.5×107/cm3时,黏附率显著下降;生长曲线示7天后BMSCs在材料上生长进入平台期,电镜示诱导BMSCs复合珊瑚7天后生长良好,且OCN从第7天开始表达.结论 诱导BMSCs-珊瑚复合物成骨活性高于无诱导细胞-材料复合物.复合物接种密度1.5×107/cm3,体外共培养7天较适宜.     

纳米P(LLA-b-CL)与犬关节软骨细胞体外生物相容性实验研究

[目的] 研究具有纳米结构二嵌段共聚物左旋聚乳酸/聚已内酯(PLLA-b-PCL)与犬关节软骨细胞的体外生物相容性,探讨其作为软骨组织工程支架的可行性.[方法] 开环聚合制备PLLA-b-PCL,液-液相分离制备PLLA-b-PCL纳米支架,扫描电镜观察材料结构:分离培养犬膝关节软骨细胞,取第3代软骨细胞接种于PLLA-b-PCL膜进行复合二维培养,MTT法检测细胞毒性;通过倒置显微镜、Hoechst33342荧光法观察细胞的形态与粘附状况;另取第3代软骨细胞与纳米PLLA-b-PCL(实验组)、PLLA-b-PCL(对照组)支架材料上进行三维培养3周,扫描电镜观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况,Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量.[结果] PLLA-b-PCL无细胞毒性,软骨细胞在纳米PLLA-b-PCL支架上粘附、增殖良好,随时间延长软骨细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加,DNA和蛋白质含量均明显高于对照组(P<0.05).[结论] PLLA-b-PCL纳米支架能为软骨细胞的生长分化提供较好的环境,具有良好的生物相容性,有望成为一种较好的软骨组织工程支架材料.     

脊索细胞培养基促进BMSCs增殖分化的研究

目的为研究椎间盘组织工程种子细胞,观察脊索细胞培养基对BMSCs增殖分化的影响。方法取4周龄日本大耳白兔胸腰段椎间盘分离培养脊索细胞,取双侧股骨分离培养BMSCs,用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养脊索细胞,5 d后制备脊索细胞培养基。实验分为两组,实验组BMSCs中加入脊索细胞培养基培养,对照组BMSCs中加入含15%FBS的DMEM/F12培养基培养。使用细胞活力细胞毒性检测检测细胞增殖情况,采用免疫荧光及实时荧光定量PCR检测BMSCs蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达情况。结果成功分离脊索细胞及BMSCs。细胞增殖检测示,培养5、7、9、14 d,实验组细胞数量明显多于对照组(P<0.05)。免疫荧光检测示对照组培养7、14 d细胞内均无或者有较少Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达,实验组二者均有较多表达,且培养14 d时表达明显多于7 d。实时荧光定量PCR检测示,培养7、14 d实验组蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05);实验组14 d蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于7 d(P<0.05)。结论脊索细胞培养基可促进BMSCs增殖,并诱导BMSCs向类软骨细胞分化,为脊索细胞和BMSCs作为种子细胞治疗椎间盘退变提供了依据。     

利用温敏胶原动态培养构建组织工程复合物的初步研究

目的研究动态培养条件下以BMSCs为种子细胞、温敏胶原(thermosensitive collagen hydrogel,TCH)为细胞黏附基质和聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)为支架材料体外构建的细胞-支架复合物形态及功能特征。方法分离Fischer344大鼠长骨来源的BMSCs,并体外扩增至第3代作为种子细胞,利用PLLA纤维编织材料作为支架,结合TCH为细胞黏附基质构建细胞-支架复合物。实验组和对照组细胞-支架复合物分别行动态培养和静态培养。体外培养7 d对两组复合物行大体观察和扫描电镜观察,检测培养0、1、3、7 d后复合物中总DNA含量。结果两种方式培养后胶原均包绕PLLA支架材料并形成致密的膜状结构。扫描电镜观察示,实验组复合物表面BMSCs呈梭形沿长轴排列整齐,细胞活性良好,表面可见绒毛凸起,纵断面见PLLA纤维之间充满胶原纤维和细胞;对照组复合物表面BMSCs呈延展状态,PLLA之间的细胞相对较少。体外培养1、3、7 d实验组细胞-支架复合物中总DNA含量均明显高于对照组(P0.05)。与培养0 d比较,两组培养1、3、7 d的总DNA含量均逐渐升高,但仅7 d时总DNA含量与培养0 d比较差异有统计学意义(P0.05)。结论利用TCH和PLLA纤维联合构建的复合细胞外基质具有良好的生物相容性,动态培养可促进BMSCs在材料表面和内部的分布,促进细胞增殖,可用于组织工程复合物的体外构建。     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

羊颈动脉脱细胞血管基质的制备及其生物相容性评价

目的研究脱细胞血管基质快速高效的制备方法并对其进行生物相容性评价,为组织工程血管的研究寻找合适的支架材料。方法取20根长50mm新鲜山羊颈动脉经-80℃冷冻、37℃水浴复温,反复冻融3次,在506MPa、4℃条件下超高压处理20min,0.125%SDS中37℃振摇(100r/min)12h,彻底去除细胞后,行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察及生物力学测定研究其组织结构的变化;Hoechst33258荧光染色和细胞DNA残留量分析评价脱细胞效果;通过接触细胞毒性实验、MTT活性测试及皮下埋植实验对制备的脱细胞血管基质进行生物相容性分析。皮下埋植实验取清洁级SD大鼠10只,体重200～230g,分为2组(n=5),实验组于大鼠背部皮下埋植结合物理化学方法处理的脱细胞血管基质,对照组埋植单纯物理方法处理的脱细胞血管基质,分别于术后1、2、3、4、8周取出行HE染色观察。结果 HE染色及Masson染色显示脱细胞血管基质无细胞成分残留,保持较完整的胶原成分;扫描电镜观察血管表面以胶原为主,适合细胞黏附;Hoechst33258荧光染色脱细胞血管基质材料未见明显阳性核染色;苯酚-氯仿提取脱细胞血管基质残留DNA含量,电泳检测分析显示其中DNA含量较正常血管显著降低;生物力学检测示脱细胞血管基质最大荷载时的应力及应变与正常血管比较差异无统计学意义,保持了正常血管的力学特征;接触细胞毒性实验与MTT法测定示脱细胞血管基质与细胞有良好的黏附性,细胞毒性为0～1级;实验组皮下埋植术后8周材料周围基本未见炎性细胞,对照组仍有明显淋巴细胞浸润。结论经反复冻融、超高压及小剂量SDS处理的脱细胞血管基质是一种构建组织工程血管的理想支架材料。