重组人肝细胞生长因子β链体外生物学活性的测定

目的　建立一种稳定灵敏的方法用于检测重组人肝细胞生长因子β链 (rhHGF β)对原代培养成年大鼠肝细胞的增生作用。方法　利用噻唑蓝 (MTT)比色方法在多种实验条件下对rhHGF β进行生物学活性检测。结果　对于体外原代培养成年大鼠肝细胞 ,rhHGF β可刺激肝细胞的增生 ,且有剂量依赖效应。 结论　确定了原代培养肝细胞检测rhHGF β生物活性的最佳条件方案     

非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞的毒性

目的研究非诺贝特对凝胶包埋培养的原代大鼠肝细胞内氧化压力和脂质含量的影响。方法将收获得到的新鲜原代大鼠肝细胞进行胶原凝胶包埋,构建肝细胞体外凝胶包埋培养模型,同时构建传统平板模型作为对照。在肝细胞培养过程中加入非诺贝特25和100μmol.L-1,分别于培养3和7 d后,检测细胞内活性氧类(ROS)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)含量,并用尼罗红和油红O对细胞内中性脂滴进行定量分析和染色观察。结果平板模型非诺贝特各组之间没有显著性差异,而凝胶包埋模型非诺贝特各组之间差异明显。对于凝胶包埋模型,非诺贝特25和100μmol.L-1均导致细胞内ROS增加,其中非诺贝特处理3 d组细胞内ROS分别为对照组的(131±19)%和(149±10)%,非诺贝特处理7 d组细胞内ROS分别为正常对照组的(121±8)%和(117±5)%(P<0.01);非诺贝特还导致了胞内MDA含量、TG和中性脂含量的显著增加(P<0.05)。结论凝胶包埋培养原代大鼠肝细胞作为体外培养模型相对于平板模型能更好地反映非诺贝特的肝毒性作用。     

原代肝细胞培养在药物代谢研究中的应用

新鲜分离和单层培养的肝细胞已应用于药理,毒理学研究的各个方面,尤其是人原代肝细胞培养成为评价细胞色素Ｐ４５０诱导与抑制的理想体外模型。本文介绍了原代肝细胞的分离,培养方法及其在药物代谢研究中的应用。     

大鼠肝实质细胞原代培养模型的研究及其功能鉴定

目的:为肝细胞功能及相关的研究提供一种客观的、简便的大鼠肝细胞原代培养模型,并鉴定肝细胞的功能。方法:在传统的两步灌流法的基础上进行改良分离培养肝实质细胞;流式细胞术测定原代肝细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;SRB法测定不同培养基对原代肝细胞的生长和功能的影响。结果:分离得到的肝细胞成活率可达90%以上,纯度可达95%以上;流式细胞术结果表明原代肝细胞大多处于G0/G1期,且基本无凋亡;SRB法和白蛋白分泌量检测结果显示,低糖DMEM组原代肝细胞生长和白蛋白分泌功能在短期内(1~5 d)与高糖DMEM组没有明显差异;RPMI1640组肝细胞的生长和功能则明显低于前两组(P<0.05)。结论:体外培养的肝细胞活力和纯度均较高,体外培养后细胞功能正常,是一种实用的体外研究肝细胞良好的细胞学模型。     

龙眼参多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究龙眼参多糖(LYS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:用四氯化碳(CCl4)体外诱导大鼠原代肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性。结果:与模型组比较,LYS组AST和ALT水平及肝细胞MDA含量明显降低,肝细胞存活率和GSH含量升高。结论:LYS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,机制可能与其抗氧化作用有关。     

大鼠肝细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨大鼠肝细胞原代培养的方法及细胞的鉴定。方法：采用胶原酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养。并采用免疫组织化学方法对其进行鉴定。结果：培养的肝细胞产量高、活力好，用相差显微镜对不同生长时期的肝细胞进行观察证实了细胞贴壁后变平变薄，双核细胞和多核细胞呈岛状连接的形态学特性，采用抗大鼠细胞角蛋白（ck18）的特异抗体进行免疫组化细胞爬片鉴定，经SP染色DAB显色后，阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒，阴性对照未见着色。结论：成功地体外培养了大鼠肝细胞并对其进行了鉴定，为进一步的实验研究奠定了基础。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用研究

目的利用原代培养正常大鼠肝细胞研究牛磺酸对肝细胞的毒性作用。方法用两步灌注法分离原代大鼠肝细胞;观察牛磺酸对原代大鼠肝细胞的毒性作用：MTT法测直接加牛磺酸的培养液和含牛磺酸大鼠血清的培养液对细胞生长抑制率的影响,计算IC50,并测定药物作用后培养液上清中AST、ALT和LDH活性及培养液中GSH和细胞内GSH的含量。结果MTT实验中细胞生长抑制率与剂量成正相关性,牛磺酸的IC50为24.23g/L。高浓度牛磺酸组培养液上清AST、ALT和LDH活性显著升高,培养液上清和细胞内GSH含量显著减少。结论高浓度的牛磺酸对体外培养的肝细胞有一定损伤。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

应用大鼠肝细胞原代培养作为短期致突变测试体外介导活化系统的研究

本研究建立了以原代培养的大鼠肝细胞作介导细胞、以中国地鼠肺V79细胞和鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株(TA100)为靶细胞的检测系统。显示前致癌物黄曲霉素B_1经肝细胞介导后致突变效应显著加强,从而证实了体外肝细胞介导活化的有效性,并讨论了在体外致突变试验中利用肝细胞作活化系统的有关问题。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

玉郎伞多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究玉郎伞多糖(YLS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用四氯化碳(CCl4)体外诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转换酶(AST)和丙氨酸氨基转换酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果:YLS(0.125~1.000g.L-1)可明显降低由CCl4升高的肝细胞培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞MDA含量,还可提高CCl4降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论:提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

大鼠胚胎器官形态分化评分法的建立及应用

为了更好地利用体外全胚胎培养技术，我们在Ｂｒｏｗｎ等人提出的形态评分系统基础上建立了体外培养大鼠胚胎组织器官形态分化评分方法，率先推出胚胎干重作为评价体外培养胚胎生长发育的指标之一；证明亚硒酸钠对体外培养的大鼠胚胎具有发育毒性。     

类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用

目的观察类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用。方法采用卡介苗(BCG)联合脂多糖(LPS)建立大鼠原代肝细胞免疫性损伤模型,测定并比较各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和一氧化氮(NO)在不同培养时间点(3,6,12和24h)的含量。结果与模型组相比较,类叶升麻苷在不同时间点均能明显降低ALT、AST和NO水平(P<0.01),且呈剂量依赖关系。结论类叶升麻苷对卡介苗联合脂多糖诱导的大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤具有保护作用。     

原代培养人肝细胞的简易高效法

二步胶原酶灌注术分离大鼠肝细胞已比较成熟,但是用大鼠肝细胞所得的实验结果还需外推于人,而人的整肝或肝叶的获取来源极其有限,不宜在一般实验室推广[1]。人肝癌细胞、传代肝细胞株等体外虽然容易增殖,但其生物学特性已发生显著变化,因此,原代人肝细胞是公认用来研究药物代谢     

高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型的建立及其在药物肝毒性评价中的应用

目的 建立一种灵敏、快速的高细胞色素P450(CYPs)酶活性的大鼠原代肝细胞模型,用于评价经CYPs酶代谢后产生肝毒性的药物。方法 分别采用苯巴比妥和β-萘黄酮两种CYPs酶广谱诱导剂构建大鼠原代肝细胞模型;应用“cocktail”探针底物法考察两种诱导剂对CYPs酶的影响;以基于CYPs酶代谢导致肝毒性的药物他克林(TAC)、双氯芬酸钠(DIC)和对乙酰氨基酚(PAR)为模型药物,评价所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型与普通大鼠原代肝细胞间灵敏性的差异;应用所构建的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型评价维拉帕米(VER)的肝毒性。结果 与普通大鼠原代肝细胞相比,3种模型药物在高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞中,在较低剂量时可使细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中活性氧(ROS)水平升高,线粒体膜电位(MMP)水平下降,或相同剂量下得到更严重的损伤结果,CYPs酶抑制剂1-aminobenzotriazole(ABT)和metyrapone(MET)能抑制这3种损伤的发生;100 μmol/L维拉帕米在普通大鼠原代肝细胞中并未引起LDH、ROS和MMP的改变,但在高CYPs活性大鼠原代肝细胞模型中,会引起细胞损伤,ABT和MET能抑制这种损伤。结论 经诱导建立的两种高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型能更灵敏的评价基于CYPs酶代谢致毒药物的肝毒性;两种诱导剂诱导得到的高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型对经不同CYPs酶亚型代谢的药物评价结果有各自优势。应用高CYPs酶活性大鼠原代肝细胞模型证实维拉帕米的致毒机制是经CYPs酶代谢产生肝毒性。     

玄参中苯丙素苷对肝细胞损伤保护作用的研究

目的：研究苯丙素苷对肝细胞损伤的保护作用。方法：通过D－氨基半乳糖造成体外和体内肝组织损伤，观察苯丙素苷对肝细胞存活率、LDH、ALT和AST的影响。结果：苯丙素苷在体外能提高肝原代培养细胞的存活率，降低LDH水平。在体内能降低衰竭大鼠ALT和AST水平。结论：苯丙素苷对D－氨基半乳糖造成肝细胞损伤具有明显的保护作用。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用

目的用原代培养正常大鼠肝细胞研究牛磺酸(β氨基酸)对肝细胞的毒性作用。方法用2步灌注法分离原代大鼠肝细胞;用MTT法测定细胞活力并计算IC50,观察药物作用后,培养液上清中AST、ALT和LDH活性及培养液中GSH和细胞内GSH的含量。结果细胞生长抑制率与剂量成正相关性,牛磺酸的IC50为24.23g.L-1。高浓度牛磺酸组培养液上清中AST、ALT和LDH活性显著升高,GSH含量显著减少。结论高浓度的牛磺酸对体外培养的肝细胞有一定损伤。     

肝细胞生长因子对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用

采用大鼠离体肝细胞原代培养２４ｈ，并利用ＣＣｌ４造成急性肝细胞损伤模型，检定肝细胞生长因子（ＨＧＦ）对肝细胞损伤的影响．结果表明：ＨＧＦ可显著降低中毒肝细胞及细胞膜脂质过氧化物水平，抑制肝细胞脂质过氧化，并降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，稳定质膜；显著促进中毒肝细胞ＲＮＡ和ＤＮＡ的合成；超微病理证实ＨＧＦ能减轻ＣＣｌ４对肝细胞质膜，染色质，线粒体，内质网及核蛋白体的损害     

肝脏体外模型及其在毒理学方面的应用

肝脏体外模型发展很快并日趋成熟。目前 ,常用的肝脏体外模型包括原代肝细胞模型、离体肝脏模型、肝脏切片模型、肝细胞系模型、亚细胞模型及基因工程细胞模型等 ,其中原代肝细胞模型最为常用。上述模型除了可以应用于药物肝脏毒性机制的研究之外 ,还可以用于药物毒性的高通量筛选。在今后的研究中 ,如何改善肝脏体外模型的培养条件及完善药物肝脏毒性研究体系是急需解决的课题。     

体外肝细胞的制备及在药物开发中的应用

体外肝细胞模型(主要是原代肝细胞培养)作为一种强有力的体外研究体系被广泛应用于化学异物的肝毒性研究.由于肝细胞具有Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶和药物转运载体.肝细胞被应用于药代动力学领域的研究,如:动力学参数、清除率、种属间比较、酶抑制和诱导效应、药物转运载体、药物一药物相互作用等.体外肝细胞模型在毒理学领域也有广泛的应用,如:细胞毒性和基因毒性物质的筛选、化学保护剂的评价、特异性肝损伤及相关生化机制的测定等.到目前为止,体外肝细胞模型已在基础性研究和新药早期筛选中,得、到广泛应用.