人野生型DNA聚合酶β在NIH3T3细胞中的定位

目的：研究人野生型DNA聚合酶β(wtDNA polβ)在NIH3T3细胞内的定位。方法：将携带人wtDNA polβ的真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—polβ,用脂质体介导的方法转染NIH3T3细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,观察wtpEGFP—C3—polβ融合基因表达。以转染空质粒pEGFP—C3的NIH3T3细胞为对照。结果：转染细胞均有GFP表达,说明转染成功,转染pEGFP—C3—polβ的细胞胞核荧光强度较胞浆强,而空质粒转染细胞胞浆胞核荧光强度无差别。结论：wtDNA polβ在NIH3T3细胞中定位于胞核内。     

稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系的建立

目的建立稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系。方法将已构建的野生型DNA聚合酶β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞,经G418筛选后得到稳定转染的细胞株,用免疫印记方法鉴定野生型DNA聚合酶β蛋白水平的表达。结果成功转染和筛选出表达外源性DNA聚合酶β基因的中国仓鼠卵巢细胞株,并检测到该基因蛋白水平的高表达。结论建立稳定表达DNA聚合酶β的细胞株,为进一步研究DNA聚合酶β高表达对细胞生物学特性的影响奠定基础。     

稳定表达缺失型DNA聚合酶β的CHO细胞系的建立

目的：建立稳定表达缺失型DNA聚合酶β（polβ）的细胞系。方法：将已构建的缺失型polβ的真核表达载体pcDNA3．1-polβ用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经G418筛选后得到稳定转染的细胞株，用RT—PCR方法鉴定细胞缺失型polβmRNA的表达。结果与结论：成功转染和筛选出表达缺失型polβ细胞株CHO—polβ，建立了稳定表达缺失型polβ的CHO细胞株。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系的建立

目的:构建稳定表达GFP-V12Rac1(组成型活化Rac1的GFP融合蛋白)的NIH3T3细胞系?方法:构建表达GFP-V12Rac1和GFP的质粒和慢病毒载体,通过慢病毒感染和流式分选获取稳定表达目的基因的NIH3T3细胞系?通过铺展实验检测GFP-V12Rac1的功能,通过Boyden chamber迁移实验检测细胞的运动能力?结果:建立了稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系及对照细胞系;稳定表达的GFP-V12Rac1可促进NIH3T3细胞的铺展,同时,构建的细胞系具备趋化运动能力?结论:用慢病毒载体可构建稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系,外源基因表达产物功能正常且细胞系具备趋化能力?该细胞系可作为研究Rac1活性定位机制的可靠细胞模型?     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3细胞系中的瞬时表达研究

目的：研究人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3中的瞬时表达情况。方法：采用脂质体转染法将携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）启动子－人胰岛素原基因的质粒转染到体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，转染后48h，用放射免疫分析方法（RIA）分别测定NIH3T3细胞内外的胰岛素水平。结果：NIH3T3细胞外的胰岛素水平于转染前后无显性变化（P＞0．05），而细胞内的胰岛素水平则于转染后明显升高（P＜0．05）。结论：转染后48h的人胰岛素原基因在NIH3T3细胞内有较高的胰岛素表达水平，使I型糖尿病的基因治疗成为可能。     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。     

稳定表达Trop-2基因的NIH3T3细胞系的构建和特性分析

目的:建立稳定表达人滋养层细胞表面抗原(Trop-2)NIH3T3细胞,分析过表达Trop-2对NIH3T3细胞的生长?增殖和侵袭特性的影响?方法:将Trop-2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,转染NIH3T3细胞,通过G418筛选及RT-PCR鉴定获得稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞(NIH3T3-Trop-2)?用MTS法检测NIH3T3-Trop-2细胞的增殖能力,软琼脂集落形成实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的克隆形成能力,明胶酶谱法检测NIH3T3-Trop-2细胞的基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌及细胞划痕实验检测NIH3T3-Trop-2细胞的迁移能力?结果:稳定表达Trop-2的NIH3T3细胞在生长增殖?克隆形成及侵袭能力均较NIH3T3细胞强,细胞培养上清中的MMP-2和MMP-9增多?结论:Trop-2对细胞的增殖与迁移能力具有明显的促进作用?     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.     

外源金属硫蛋白基因表达对NIH3T3细胞耐寒力的影响

目的：研究金属硫蛋白基因对细胞耐寒力的影响．方法：通过将金属硫蛋白基因（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,ＭＴ）的表达载体ｐＢＡｃＮｅｏ－ＭＴⅡＡ转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）,筛选获得了高表达ＭＴ的细胞克隆ＭＴ１（ＭＴ阳性细胞百分比为２９．４％）,用四唑盐（ＭＴＴ）比色实验观察了该细胞的生长曲线以及不同低温条件下的存活能力,并通过电镜观察超微结构以进一步证实．结果：与转染ｐＢＡｃＮｅｏ空载体的细胞克隆Ｎｅｏ相比,常温下二者的增殖能力无显著差别．在不同的低温条件下,存活能力都受到一定程度的影响,细胞克隆ＭＴ１的存活细胞数明显高于阴性对照（Ｐ＜０．０１）,超微结构改变不明显．结论：上调金属硫蛋白基因表达可能具有增强耐寒的能力．     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

大肠癌细胞线粒体DNA与NIH3T3细胞核基因组整合的荧光原位杂交分析

目的:观察大肠癌细胞突变的线粒体DNA(mtDNA)转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,mtDNA与转染细胞核内基因组的整合情况.方法:将携带大肠癌细胞突变mtDNA的重组质粒pcDNA3.1( )-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1( )-NHWBC mtDNA及空质粒pcDNA3.1( )通过脂质体法转染NIH3T3细胞.同时用PCR法制备3条相应的绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针.分离转染的NIH3T3细胞核内染色体,用荧光原位杂交(FISH)法检测mtDNA探针与核内基因组的整合情况.结果与结论:瞬时转染的NIH3T3细胞核基因组上存在mtDNA的同源序列.外源肿瘤细胞mtDNA与NIH3T3细胞核内基因组发生整合.     

突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。     

野生型DNA聚合酶β转染Eca-109细胞后增变基因表型变化

目的:探讨野生型DNA聚合酶β(polbeta)转染人食管癌Eca-109细胞后对其增变基因表型的效应.方法:将经过鉴定的重组pcDNA 3.1质粒(插入野生型, wt)-polbeta转染培养的人食管癌Eca-109细胞.将Eca-109细胞分为3组:转染实验组(E)、空质粒转染对照组(C1)和未转染对照组(C2).应用原位杂交技术显示wt-polbeta和wt-p53的杂交信号,免疫细胞化学染色显示POLB-免疫反应性(IR)和多药耐受(MDR1)-IR,免疫印迹显示wt-polbeta和突变(mt)-polbeta的带型,细胞化学技术检测各组细胞的增殖与分化细胞的比率.结果:polbeta免疫印迹结果显示E组呈现增强的wt-polbeta主带, C1、C2 组呈现很弱wt-polbeta主带和显著突变的(mt)-polbeta主带(P<0.01);polbeta免疫细胞化学结果显示E组的强信号定位于细胞核内,C1、C2 组信号皆很弱(P<0.01).E组的wt-polbeta及 wt-p53原位杂交的信号强于C1、C2 组(P<0.01).E组MDR1的免疫反应性和增殖与分化细胞的比率低于C1、C2 组(P<0.01).结论:wt-polbeta转染的Eca-109细胞呈现wt-polbeta及wt-p53表达上调而mt-polbeta及MDR1表达下调的增变基因表型减弱.     

野生型DNA聚合酶β在肺腺癌细胞中的表达研究

目的研究人野生型DNA聚合酶β基因编码的蛋白质在肺腺癌A549细胞株内的表达。方法将人重组的携带野生型的DNA聚合酶β基因真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-polβ用脂质体介导的方法转染A549细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,RT-PCR检测其在核酸水平的表达。结果野生型的DNA聚合酶β基因转染细胞后主要定位于细胞核内,而不含DNA聚合酶β基因的空质粒转染细胞后则主要表达在胞浆中,RT-PCR证实转染细胞中的野生型的DNA聚合酶β比未转染细胞表达量高。结论野生型的DNA聚合酶β基因在A549细胞中表达,且定位于胞核内,这对进一步研究肺癌的发生发展奠定了基础。     

互隔交链孢酚致DNA聚合酶β基因突变的实验研究

目的观察互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β(DNApolβ)基因突变的影响,研究互隔交链孢酚致癌可能的机制。方法NIH/3T3细胞分为两组:①各正常细胞组;②AOH组,AOH浓度为8μmol·L-1。用RTPCR方法从细胞全RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,应用TA克隆技术,克隆至pGEMTeasy载体后进行测序,分析序列变化。结果测序后发现正常组DNA聚合酶β基因序列无任何变化,AOH组中228位点发生TC突变(导致39号氨基酸由Tyr变为His),319位点也有TC突变(导致69号氨基酸由IIe变为Thr)。结论AOH可导致NIH/3T3细胞中的DNA聚合酶β发生点突变,推测AOH的致癌作用可能与引发细胞中DNA聚合酶β基因突变有关。