人脐带血内皮祖细胞体外培养、增殖和迁移

对血管内支架进行内皮化,有可能防止支架内再狭窄的发生,具有广阔的临床应用前景。文章采用新鲜脐血中分离的单个核细胞,在包含碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的环境中培养及扩增,经过形态学对比,结合免疫荧光法和流式细胞仪鉴定贴壁细胞;并与同期采集的脐静脉内皮细     

体外高浓度葡萄糖培养及黄芪干预人外周血内皮祖细胞的数量和增殖与分化

背景：内皮祖细胞数量及功能受损是糖尿病血管并发症发生发展的重要环节,黄芪对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用,可以有效保护血管内皮功能。目的：观察高浓度葡萄糖及黄芪干预对人外周血内皮祖细胞数量、增殖及分化影响。方法：不同浓度葡萄糖孵育内皮祖细胞24h以及30mmol/L葡萄糖孵育内皮祖细胞不同时间;内皮祖细胞经20g/L黄芪预处理24h后,再加入30mmol/L葡萄糖培养24h。结果与结论：高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少内皮祖细胞的数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力（P0.05或0.01）,给予黄芪预处理后,内皮祖细胞数量明显增加,增殖及向内皮细胞系分化能力明显增强（P〈0.05或0.01）。提示高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少外周血内皮祖细胞数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力,黄芪可以改善高葡萄糖对内皮祖细胞的损伤作用。     

体外高浓度葡萄糖培养及黄芪干预人外周血内皮祖细胞的数量和增殖与分化

背景:内皮祖细胞数量及功能受损是糖尿病血管并发症发生发展的重要环节,黄芪对多种原因引起内皮功能障碍具有保护作用,可以有效保护血管内皮功能。目的:观察高浓度葡萄糖及黄芪干预对人外周血内皮祖细胞数量、增殖及分化影响。方法:不同浓度葡萄糖孵育内皮祖细胞24h以及30mmol/L葡萄糖孵育内皮祖细胞不同时间;内皮祖细胞经20g/L黄芪预处理24h后,再加入30mmol/L葡萄糖培养24h。结果与结论:高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少内皮祖细胞的数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力(P0.05或0.01),给予黄芪预处理后,内皮祖细胞数量明显增加,增殖及向内皮细胞系分化能力明显增强(P<0.05或0.01)。提示高葡萄糖以浓度及时间依赖方式减少外周血内皮祖细胞数量,降低内皮祖细胞的增殖及向内皮细胞系分化能力,黄芪可以改善高葡萄糖对内皮祖细胞的损伤作用。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景:目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的:分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法:密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论:随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示:培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P<0.05),并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占（77.4±4.9）%、（52.4±6.6）%和（19.4±2.1）%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占（81.1±7.4）%和（7.6±3.1）%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞（P〈0.05）,并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

脑梗死患者血管内皮黏附分子-1和P-选择素水平变化

目的：观察脑梗死患者血管黏附分子-1（VCAM-1）和 P-选择素水平的变化,探讨 VCAM-1和 P-选择素在脑梗死损伤中的作用。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定58例脑梗死患者和36例体检健康者（对照组）的血清 VCAM-1和 P-选择素水平,比较两组间的差异;动态观察脑梗死患者 P-选择素水平变化。结果脑梗死患者血清 VCAM-1和 P-选择素水平均显著高于对照组（P＜0.01）,且都与梗死体积成显著正相关。P-选择素水平在脑梗死后24 h 内达最高峰,呈下降趋势,至72 h 时接近正常。结论脑梗死患者血清 VCAM-1和 P-选择素参与了脑梗死的病理过程。     

血必净注射液对内毒素刺激内皮祖细胞增殖和黏附功能的影响

目的 观察细菌内毒素脂多糖(LPS )刺激人内皮祖细胞(EPCs )后不同浓度血必净注射液对其增殖、黏附功能的影响.方法 将EPCs 经复苏、培养、传代、鉴定为正在分化的EPCs 后,等量接种到培养板上,随机分为空白对照组[微血管内皮细胞培养液-2(EGM-2MV)]、LPS 组(100 μg/L)、血必净1 组(LPS 刺激EPCs 后加入5、25 、50 g/L 血必净注射液共同孵育)、血必净2 组(LPS 加5、25 、50 g/L 血必净注射液同时孵育EPCs),应用四甲基偶氮唑盐(MTT )比色法测定EPCs 的增殖和黏附能力[吸光度(A)值].结果 与空白对照组比较,LPS 组EPCs 增殖、黏附能力均显著降低(增殖能力:0.1077±0.0026 比0.1248±0.0037,黏附能力:0.0647±0.0020 比0.0770±0.0052,均P＜0.05);与LPS 组比较,不同浓度血必净组EPCs 增殖能力均明显提高,且呈剂量-效应关系(均P＜0.05),EPCs 黏附能力有所改善,但未见明显剂量-效应关系,以血必净1 组25 g/L 浓度升高更显著(0.0855±0.0030,P＜0.05).结论 单纯LPS 刺激可导致EPCs 增殖、黏附能力下降;血必净注射液可使受损的EPCs 增殖、黏附能力改善,其中增殖能力随血必净注射液剂量增加而增强,而黏附能力与血必净注射液剂量间未见明显关系.提示血必净注射液可不同程度中和LPS 对EPCs 的损伤,在革兰阴性杆菌所致脓毒症早期使用血必净注射液可能有更好的效果.     

高迁移率族蛋白1、Toll样受体4和血管细胞黏附因子1与狼疮性肾炎血脂异常的关系

目的探讨高迁移率族蛋白1(high mobility group protein,HMGB-1)、Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)和血管细胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)与狼疮性肾炎(LN)血脂异常和动脉粥样硬化(atheroscleros,AS)的关系。方法收集20例正常健康人、30例系统性红斑狼疮(SLE)无肾脏损害和35例LN患者外周静脉血,检测血脂水平、HMGB1mRNA、TLR-4mRNA、血清HMGB1蛋白水平、外周血单核细胞CD14+/VCAM-1表达。结果 LN组患者血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显高于SLE组和正常对照组(P0.01);LN组患者血清中HMGB1表达量(9.86±1.54)g/L高于正常对照组(7.85±0.75)g/L和SLE组(7.46±1.53)g/L;HMGB1mRNA和TLR4mRNA表达亦升高(P0.01),SLE组和正常对照组差异无统计学意义;与SLE组和正常对照组比较,LN组单核细胞中CD14+/VCAM-1表达明显增强;在LN组患者外周血中HMGB1表达与TLR4、血脂(TG、LDL-C)呈正相关(r=0.915、0.536、0.448,P0.05或0.01)。结论在LN发病过程中晚期炎症介质HMGB1可能通过与TLR4结合,促进单核细胞表面VCAM-1表达,从而引起血脂异常,参与AS的形成。     

胚胎干细胞来源的BL-CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞

小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)体外分化2，5—3．5天形成的拟胚体(embryoid body，EB)中可产生原始细胞集落形成细胞(blast dtony—forming cell，BL—CFC)，后具有造血和内皮细胞双向分化潜能，是目前体外实验可检测到的最早期的定向造血分化的细胞。本研究建立BL—CFC培养体系，并通过造血祖细胞集落培养、免疫荧光标记以及巢式RT—PCR鉴定单个原始细胞集落来源的贴壁细胞和非贴壁细胞的分化特点。结果表明：部分贴壁细胞吞噬DiI—Ac—LDL。并表达CD31，UEA—I，VF—cadtherin等内皮细胞特异性的表面分子；非贴壁细胞具有原始造血(primitive hematopoiesis)和(或)永久造血(definitive hematopoiesis)活性，其中20％的原始细胞集落含有高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential colony—forming cell，HPP—CFC)，后能形成次级造血集落。结论：胚胎干细胞来源的BL-CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞，但原始细胞集落来源的HPP—CFC是否具有体内造血活性有待进一步的研究证实。     

差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究

本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSC）和内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPC）的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术（FCM）检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似＂S＂形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为（93.32±1.65）%、EPC G0-G1为（93.05±1.95）%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为（99.7±1.12）%、（99.1±2.33）%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为（4.8±0.38）%、（6.8±0.49）%及（0.4±0.08）%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（82.1±3.4）%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为（74.2±3.2）%、（64.7±4.3）%及（43.5±1.5）%,鉴定为EPC。结论：应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。     

脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系，从脐血分离单个核细胞，在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞，利用摄取乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac—LDL）和结合欧洲荆豆凝集素（Ulex European Agglutinin 1，UEA—1）进行鉴定，并进一步用免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测。结果表明，这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA—1，表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF），有CD31、酪氨酸激酶受体（kinase tyrosine insert domain receptor，KDR）、CD144和内皮一氧化氮合成酶（endothelial NO synthase。ENOS）的基因转录。但是，它们的增殖能力明显不同，分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞。流式细胞计数结果显示，这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异。结论：利用含内皮细胞条件培养液的培养体系，成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞。     

吡格列酮对大鼠骨髓内皮祖细胞迁移功能的影响及其机制探讨

目的观察选择性过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂吡格列酮（Pioglitazone,PIO）对大鼠骨髓EPCs（Endothelial progenitor cells,EPCs）迁移的影响及并对其机制进行初步探讨。方法使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养大鼠骨髓EPCs,并使用双荧光染色的方法进行鉴定。将大鼠骨髓EPCs置于含不同质量浓度PIO的培养基中培养,检测EPCs的迁移情况。将培养7天的EPCs分5组,分别加入一定浓度的PIO;PPARγ拮抗剂GW9662;PIO及及PI3K/Akt通道阻滞剂Wortmannin;PIO及ERK通道阻滞剂PD98059;并设立空白对照组,检测EPCs的迁移情况。结果在PIO为50μmol/L时,可最大程度促进EPCs的迁移。这种作用在PI3K/Akt通道阻滞剂Wortmannin及PPAR-γ拮抗剂GW9662存在时作用消失,而在ERK通道阻滞剂PD98059作用下仍存在。结论 PIO可促进大鼠骨髓EPCs的迁移,这种作用可能是通过PI3K/Akt信号通路介导。     

低氧诱导因子过表达对人外周血内皮祖细胞分化影响的体外研究

为了研究低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）在体外对人外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）向血管内皮细胞（endothelial cells,EC）分化的影响,用密度梯度离心法分离人外周血EPC,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPC,计算转染效率,RT-PCR方法测定HIF-1α、HIF-1β及HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）mRNA在质粒转染前后含量变化,免疫细胞化学方法检测在常氧下HIF-1α蛋白在HIF-1α质粒转染前后不同时点蛋白表达情况,细胞膜表面抗原决定簇流式细胞术测定FITC-CD31^＋EPCs/EC在未转染组、pEGFP空质粒或HIF-1α质粒转染组转染3-10天后的组间差异,光镜下观察转染前后细胞形态及分化程度.结果表明：EPC获得后经电穿孔转染,质粒转染效率约20%;RT-PCR示HIF-1α mRNA在常氧中有表达,并在HIF-1α过表达组合量增加（P＜0.05）;其下游靶基因VEGF在HIF-1α过表达组表达上调（P＜0.05）;HIF-1β表达在各组中无明显差异（P＞0.05）.免疫组织化学显示常氧下HIF-1α蛋白无表达,转染HIF-1α质粒12小时后HIF-1α蛋白表达阳性,转染24小时后蛋白表达阴性.流式细胞仪检测显示电穿孔转染HIF-1α质粒使CD31＋细胞的百分比增加（P＜0.05）.细胞形态学观察显示：未转染及pEGFP空质粒转染组细胞在培养6天后呈集落样散在分布,培养14天后贴壁细胞部分呈梭样;穿孔转染的HIF-1α质粒组细胞于培养6天后集落周边分化出梭样贴壁细胞,培养14天后呈梭样,或铺路石样牢固贴壁.结论：HIF-1α质粒能有效地用于基因干扰治疗,有助于EPC向EC分化,为体内研究奠定了基础,也为进一步体内诱导血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择.     

The Increase of VEGF Secretion From Endothelial Progenitor Cells Post Ultrasonic VEGF Gene Delivery Enhances the Proliferation and Migration of Endothelial Cells

We investigated the feasibility of exogenous gene expression in endothelial progenitor cells (EPCs) through the use of ultrasonic microbubble transfection (UMT). EPCs originating from porcine peripheral blood were cultured in a medium containing constructed vascular endothelial growth factor (VEGF) pDNA followed by UMT. Simultaneously, comprehensive functional evaluations were conducted to investigate the effects of UMT of the VEGF gene on the EPCs. The results showed that UMT yielded significant VEGF protein expression. VEGF-containing supernatant originating from EPCs post UMT led to significantly enhanced activities of proliferation by more than 20% and migration by approximately 30% in human aortic endothelial cells. The duration of additional secretion of VEGF protein attributable to the exogenous VEGF gene in the EPCs post UMT lasted more than 96 hours. In conclusion, UMT successfully delivers the VEGF gene into porcine EPCs, and VEGF-containing supernatant derived from EPCs post UMT enhances the proliferation and migration of human aortic endothelial cells.     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

人参皂甙Rg1和Rb1对骨髓粒—巨噬系祖细胞增殖的作用

用体外造血祖细胞集落形成技术,观察人参皂甙Rg1和Rb1对正常人粒巨噬系祖细胞(CFU-GM)的刺激增殖作用.实验结果表明Rg1浓度为2.5,5,10和50μg/ml时CFU-GM集落产率均显著高于对照组(P＜0.01),提高率分别为(39.8±3.6)%,(70.6±6.8)%,(63.0±6.4)%和(60.8±5.9)%.Rb1浓度为0.5,2.5,5,10和50 μg/ml时CFU-GM集落产率均明显高于对照组(P＜0.05),提高率分别为(24.5±2.3)%,(45.6±4.7)%,(54.6±6.1)%,(65.1±6.3)%和(58.3±5.7)%.高浓度(50μg/ml)不显示抑制作用.上述结果说明,Rg1和Rb1对CFU-GM具有明显的刺激增殖作用,且高浓度时亦不抑制.     

过氧化损伤对内皮细胞和红细胞黏附性的影响

本文用LDH方法检测到H2O2造成内皮细胞较弱损伤的浓度为0．25mmol，温浴时间30min为宜，以此为条件观察过氧化对于红细胞和内皮细胞间的黏附作用。将实验分为4个组，即正常红细胞对正常内皮细胞间黏附组，过氧化红细胞对正常内皮细胞间黏附组，正常红细胞对过氧化内皮细胞间黏附组，过氧化红细胞对过氧化内皮细胞间组黏附组。发现：红细胞被过氧化，明显引起红细胞在正常内皮细胞表面的黏附数增加；内皮细胞被过氧化，不引起正常红细胞在其表面的黏附数增加，并比对照组下降；发现红细胞和内皮细胞两者均被过氧化，黏附细胞数与第一种情况相近。对细胞黏附牢固性。用相关性回归发现斜率的倒数值，对照组为0.62Pa，红细胞过氧化组为0．68Pa，内皮细胞过氧化组为1．05Pa，两种细胞过氧化组为0．68Pa，故说明红细胞单方、内皮细胞单方、或红细胞和内皮细胞双方过氧化，均引起吸附的牢度增强。