人参皂甙Rb1、Rb3、Rg1对培养皮层神经细胞的抗缺血效应及其机制

目的研究人参皂甙(Ginsenosides，GS)的3种单体成分GSRb1、Rb3、Rg1对培养的皮层神经细胞的抗缺血效应及其机制。方法体外培养小鼠胎鼠大脑皮层神经细胞，观察缺血／再灌注对神经细胞的毒性及(GSRb1、Rb3、Rg1的保护作用。结果培养的小鼠胎鼠大脑皮层神经细胞缺血／再灌注损伤后，细胞出现明显损伤性变化．神经细胞活性降低，电镜观察显示神经细胞呈变性至坏死等不同程度的损伤，死亡率明显升高．培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量增加，而细胞匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)含量明显减少．丙二醛(MDA)生成显著增多。GSRb1、Rb3、Rg160μmol／L能不同程度地抑制缺血／再灌注引起的损伤性改变，培养上清液中LDH释放减少，而细胞匀浆中SOD含量明显增加．MDA生成显著降低。结论(1)GSRb1、Rb3、Rg1对神经细胞有明显的抗缺血效应；(2)GSRb1、Rb3、Rg1抗缺血的作用机制可能与其提高神经细胞抗氧化能力、减少自由基的生成，保护细胞的结构与功能有关。     

利培酮对N-甲基-D-门冬氨酸诱导的大鼠皮层神经细胞损伤保护作用的研究

目的探讨利培酮对N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)诱导的大鼠皮层神经细胞损伤的作用。方法清洁级Sperague-Dawley妊娠大鼠3只,孕期17~19 d。用50 μmol／L NMDA处理原代培养的大鼠皮层神经元15 min,观察不同浓度(0.1 μmol／L,1 μmol／IL,10 μmol／L)的利培酮对这种损伤的作用。结果 NMDA(50 μmol／L)处理15 min能显著增加上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.01),明显降低皮层神经细胞甲基噻唑基四唑(MTT)比色后的吸光度(P<0.01)。1μmol／L浓度水平的利培酮能抑制NMDA诱导的大鼠皮层神经元LDH的释放,使MTT比色增强,明显改善损伤后的神经元形态。结论利培酮对NMDA诱导的大鼠皮层神经元的损伤有保护作用。     

人参皂甙Rb1对模拟缺血环境中的大鼠神经元胞内游离钙的影响

目的探讨人参皂甙Rb1(GSRb1)对模拟缺血环境中的大鼠神经元胞内游离钙的影响。方法对大鼠胚胎脑海马神经元进行体外培养,将其置于正常细胞外液(正常对照组)、模拟缺血的细胞外液(缺血组)、无钙的模拟缺血液(缺血+无钙组)、以及模拟缺血液+不同浓度的GSRb1溶液[缺血+GSRb1(20、40、60、80μmol/L组)],采用激光共聚焦技术测定各组细胞内钙荧光强度,并计算与正常对照组相比荧光强度变化百分比。结果与正常对照组相比,荧光增强度缺血组为(73.5±10.31)%,缺血+无钙组为(4.5±2.58)%,缺血+不同浓度GSRb1组(20、40、60、80μmol/L组)分别为(20.2±3.41)%、(13.6±2.98)%、(10.5±3.62)%和(12.7±4.51)%;缺血+各浓度GSRb1组的荧光增强度明显小于缺血组(均P<0.01)。结论缺血缺氧时神经细胞内游离钙的上升主要是来自细胞外钙离子内流;GSRb1可通过抑制细胞外钙离子内流,减轻细胞内的钙超载,保护缺血神经元;保护作用呈浓度依赖性,在60μmol/L时达到最大。     

9种人参皂甙对培养鼠胚脊髓神经元生长的影响

目的:探讨9种主要人参皂甙单体对体外培养鼠胚脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元生长的影响。材料和方法:孕期15d的SD雌鼠,取其胎鼠,消化法混合培养鼠胚脊髓运动神经元和脊神经节感觉神经元;MTT法观察9种人参皂甙单体(Rb1、Rb3、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、Rh2)对脊髓神经元生长的影响。结果:人参皂甙Rg1、Rb1、Re,Rf、Rh1可明显提高体外培养神经元的活力(P<0.01);而Rb3、Rd、Rg2、Rh2对脊髓神经元活力无明显影响(P>0.05)。结论:人参皂甙对周围神经具有保护神经元作用。     

一种稳定阿尔茨海默病细胞模型的建立方法

目的旨在应用不同浓度Aβ_(1-42)诱导新生SD大鼠海马神经元,建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。方法分离并培养新生24 h内SD大鼠原代海马神经细胞;分别加入不同浓度Aβ_(1-42)诱导,诱导后采用MTT法观察细胞活力,选取理想Aβ_(1-42)诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型;通过免疫荧光技术(IF)鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)在海马神经元细胞的表达。结果 Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降,可导致海马神经元细胞胞体变形、收缩和细胞膜完整性破坏,胞间网络结构消失或断裂,细胞外基质乱不清,神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降与Aβ_(1-42)浓度成线性关系;加入不同浓度Aβ_(1-42)(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L)后实验各组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%,(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%,其中20μmol/L组与0μmol/L组相比P<0.05,30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L组与对照组相比P<0.01。结论 Aβ_(1-42)可导致海马神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。     

阿托伐他汀对淀粉样β蛋白诱导大鼠原代海马神经元损伤保护作用的研究

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ato)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的体外培养原代海马神经元损伤保护作用。方法选用出生0~24hSprague-Dawley大鼠乳鼠,解剖显微镜下分离海马,进行海马神经元体外培养,培养10d后用于实验。将培养的海马神经元分为3组:(1)正常对照组:加入含有1%(质量浓度)DMSO培养基;(2)Aβ1-42组:加入1.25μmol/L Aβ;(3)Aβ(1.25μmol/L)+不同浓度阿托伐他汀组(0.1、0.5、1、2.5μmol/L)。应用CellTiter-GloTM荧光细胞活性试剂盒检测培养海马神经元ATP含量,用以反映神经元活力;通过CytoTox-ONETM试剂盒测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用以测定神经元细胞膜的损伤程度;应用免疫荧光染色观察神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表达。Western印迹法半定量检测海马神经元突触蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改变。结果与正常对照组比较,培养10d海马神经元经1.25μmol/L Aβ1-42作用48h后,其ATP和LDH水平均明显降低(均P0.01),而0.5、1.0、2.5μmol/L Ato组能够明显抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P0.01)。免疫荧光及Western blot结果显示,1.25μmol/L Aβ1-42可使海马神经元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达明显降低,而Ato能够明显抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表达降低。结论 Ato对Aβ诱导的体外培养海马神经元毒性有保护作用,这种保护作用可能与Ato对抗Aβ1-42引起的海马神经元SYP、PSD-95、bassoon表达降低有关。     

刺五加皂甙对神经元谷氨酸毒性损伤的保护作用

目的:观察不同谷氨酸浓度和谷氨酸作用不同时间对神经元活性的影响,探讨细胞损伤后刺五加皂甙(ASS)的有效保护浓度。方法:取孕13～15dICR小鼠,无菌条件下对胎鼠大脑皮层神经元进行原代分离培养,建立谷氨酸诱导的皮层神经元损伤模型。用MTT、LDH测定神经元活性,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并在电镜下观察细胞形态学变化。结果:①经谷氨酸处理的神经元,其细胞存活率呈剂量和时间依赖下降、ASS能不同程度提高细胞存活率。②谷氨酸处理组的神经元凋亡率、LDH释放量和NO含量均升高,与正常对照组及ASS组比较有明显差异(P<0.01)。结论:一定浓度的ASS对谷氨酸引起的神经元损伤有保护作用;ASS可能是通过抑制NO的释放和稳定细胞膜,拮抗细胞元损伤。     

氧化苦参碱对缺血再灌注损伤小鼠原代海马神经元的保护作用及机制研究

目的 探讨氧化苦参碱对缺血再灌注损伤海马神经元的保护作用及其机制。方法 将小鼠原代海马神经元分为正常对照组、缺血再灌注组和氧化苦参碱组。正常对照组海马神经元予以常规培养;缺血再灌注组海马神经元用氧葡萄糖剥夺/再恢复培养模拟缺血再灌注损伤;氧化苦参碱组海马神经元在氧葡萄糖剥夺后再恢复前,予以200μg/m L氧化苦参碱。采用流式细胞仪检测各组海马神经元内的游离钙离子浓度;用Western blot法检测各组海马神经元的Cav1. 2蛋白表达水平;用膜片钳技术检测各组海马神经元的L型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)功能。结果 与缺血再灌注组相比,氧化苦参碱组海马神经元的游离钙离子浓度、Cav1. 2蛋白表达量及LTCC功能均明显降低(均P 0. 05);但仍未恢复到正常对照组水平(均P 0. 05)。结论 氧化苦参碱可能通过减少小鼠原代海马神经元的Cav1. 2表达和LTCC功能,降低细胞内游离钙离子的浓度,从而发挥对缺血再灌注损伤神经元的保护作用。     

天麻素后处理对糖氧剥夺大鼠皮层神经元EphA4表达的影响

目的研究天麻素对糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)大鼠皮层神经元损伤的保护性作用及EphA4表达的影响。方法提取新生大鼠大脑皮层神经元体外培养7 d,对4组神经元分别施以60 min的OGD,换回正常培养液培养30 min后分别及给予含终浓度为50、125、250、500μmol/L天麻素的培养液作为后处理措施,培养4 h后换回正常条件培养24 h;采用倒置相差显微镜观察神经元形态学变化,LDH活性测定检测神经元损伤情况,CY3荧光染色检测EphA4表达变化。结果天麻素后处理能降低糖氧剥夺神经元的损伤,降低EphA4表达。结论天麻素对糖氧剥夺神经元损伤有保护作用,该作用与EphA4表达降低有关。     

银杏内酯B抗缺血神经元凋亡的预适应作用

目的研究银杏内酯B(Ginkgolide B,GB)对缺血引起的神经元凋亡的影响,并从预适应角度探讨其可能的机制。方法原代培养的小鼠皮层神经元,经过短时缺血预适应(1%O2,无糖DMEM)或GB预处理(120μmol/L,24h)后,再进行严重缺血损伤,通过MTT比色法观察细胞的活性,Hoechst 33342荧光染色检测细胞的凋亡;Western-blot分析磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)和活化的Caspase-3蛋白表达量的变化。结果神经元缺血后活性下降,凋亡比率增高;缺血预适应或银杏内酯B预处理可提高缺血神经元p-GSK-3β的表达,抑制Caspase-3的活化,提高缺血神经元的活性,降低凋亡比率。结论银杏内酯B对缺血诱导的神经元凋亡具有拮抗作用,其作用机制与缺血预适应相似,两者均能提高p-GSK-3β的表达,抑制Caspase-3的活化,银杏内酯B对神经元可发挥药理性预适应作用。     

分子血红蛋白对培养胎鼠脊髓神经元的毒性及其机制研究

目的　探讨分子血红蛋白 (MHb)的生物活性 ,为该类血液代用品在脑复苏领域的应用提供理论依据。方法　采用 12～ 15 d胎鼠脊髓神经元进行原代分散培养 ,观察 1、10、5 0μmol/ L不同浓度 MHb对神经元形态和活性的影响。结果　作用 2 4h时各实验组脊髓神经元均观察到毒性反应 ,神经元活性也明显低于空白对照组 (P<0 .0 1)。超氧化物歧化酶 (SOD)和甘露醇能够抑制 MHb的毒性作用。结论　氧自由基介导了 MHb对脊髓神经元的毒性作用 ,提示对 MHb进行修饰来防止自由基生成的必要性。     

刺五加皂甙对皮质神经元缺血缺氧性损伤的保护作用

目的探讨刺五加皂甙(ASS)对皮质神经元缺血缺氧性损伤的保护作用。方法胎鼠皮质神经元经缺血缺氧和谷氨酸(Glu)作用模拟缺血性皮质神经元损伤模型。随机分成缺血缺氧组(HI组)、Glu组、ASS组和对照组;ASS组在实验前、中均加入终浓度为50mg/L的ASS。用流式细胞仪检测神经元凋亡率,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的含量,用3[4,5二甲基磺胺噻唑]2,5二苯基四唑溴化物(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)释放量测定神经元活性,电镜下观察细胞形态学变化。结果(1)随着缺血缺氧时间延长神经元存活率逐渐下降,至缺血缺氧8h达到高峰;Glu作用的神经元,其存活率随作用时间延长而下降。(2)HI组及Glu组皮质神经元存活率显著低于正常对照组,LDH释放量、NO含量及凋亡率均显著高于对照组(均P<0.05);与HI组和Glu组比较,HI ASS组及Glu ASS组皮质神经元的存活率显著升高,而LDH释放量、NO含量及凋亡率均显著降低(均P<0.05)。结论ASS能提高缺血神经元存活率、降低凋亡率,抑制NO和LDH释放,从而起到神经保护作用。     

神经生长因子对糖皮质激素诱导大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的探讨神经生长因子对糖皮质激素诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用。方法体外分离原代培养18只新生Wister大鼠海马神经元,噻唑蓝法测定地塞米松诱导海马神经元凋亡的最低敏感剂量,观察不同质量浓度神经生长因子对地塞米松(0.10×10~(-6)mol/L)诱导海马神经元凋亡的保护作用。结果与阴性对照组相比,地塞米松Ⅰ组(10×10~(-6)mol/L)、Ⅱ组(1×10~(-6)mol/L)和Ⅲ组(0.10×10~(-6)mol/L)大鼠海马神经元活性均降低(P=0.000,0.000,0.000)。予不同质量浓度神经生长因子后,神经生长因子0.18 ng/ml组大鼠海马神经元活性低于阴性对照组(P=0.000)和阳性对照组(P=0.010),神经生长因子18 ng/ml组大鼠海马神经元活性高于阳性对照组(P=0.000)和神经生长因子0.18 ng/ml组(P=0.000)。结论糖皮质激素可以诱导体外培养的大鼠海马神经元凋亡,地塞米松0.10×10~(-6)mol/L是诱导海马神经元凋亡的最低敏感剂量,神经生长因子可以拮抗地塞米松诱导的大鼠海马神经元凋亡。     

N-乙酰半胱氨酸抗谷氨酸诱导海马神经元损伤的研究

目的　观察N-乙酰半胱氨酸(N- acetylcysteine,NAC)对不同浓度谷氨酸(Glutamte,Glu)诱导海马神经元损伤的影响,探讨其作用机制,评价毒性作用。方法　采用台盼蓝活细胞拒染与TUNEL法比较不同浓度NAC预处理3d给药与细胞毒性暴露后快速给药对10 0μmol/ L、5 0 0μm ol/ L Glu诱导体外培养海马神经元损伤的影响,并与MK- 80 1比较;利用激光扫描共聚焦显微镜(L SCM)观测细胞内Ca2 浓度变化;采用台盼蓝活细胞拒染、原子力显微镜(AFM)及细胞内酯酶活性判定方法评价NAC毒性。结果　NAC可降低10 0μmol/ L Glu诱导的海马神经元死亡率,以预处理组为佳,1m mol/ L NAC预处理保护效果类似于10μmol/ L MK - 80 1;NAC对5 0 0μm ol/ L Glu诱导的海马神经元损伤无保护作用。1mm ol/ L NAC预处理抑制Glu诱导的神经元Ca2 内流。经10 0 mmol/ L NAC作用的细胞虽然形态完整,但台盼蓝染色蓝染,失去对Glu毒性的反应性;AFM扫描见神经元细胞膜皱缩;培养基Ca2 经Fluo- 3(AM)标记后L SCM下无激发荧光。结论　NAC对轻度Glu细胞毒性损伤有保护作用,预防性用药效果更优越。认为抑制Glu诱导的神经元Ca2 内流为其保护机制之一。高浓度NAC具有固定作用     

姜黄素对AMPA/KA受体介导大鼠海马神经元钙内流的影响

目的 探讨姜黄素对α-氨基-3-羧基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(AMPA)/海人酸(KA)受体介导大鼠海马神经元钙内流的影响.方法 选用胚胎17dSD鼠分离海马,离体培养海马神经元,借助活体钙荧光染色和激光共聚焦钙成像技术观察100μmol/LKA刺激海马神经元内钙的变化,不同浓度(5、10、15、30、50 μmol/L)姜黄素预孵育海马神经元30min对100μmol/L KA刺激下细胞内钙变化的影响,15 μmol/L姜黄素对不同浓度(10、30、50、100、200、300 μmol/L)KA刺激海马神经元内钙变化的影响.应用钴染色技术观察(30、100 μmol/L KA)刺激后海马神经元钴阳性染色细胞变化.姜黄素预孵育30min对KA刺激导致钴阳性染色细胞变化的影响.结果 不同浓度姜黄素预孵育30 min均可以明显缓解100 μmol/L或30 μmol/L KA导致的细胞内钙升高程度.差异均有统计学意义(P<0.05),其中15 μmol/L姜黄素作用最为明显.30μmol/L或100 μmol/LKA刺激均可以引起海马神经元钴染色阳性细胞增加,15 μmol/L姜黄素预处理30 min后明显减少钴染色阳性细胞,差异有统计学意义(P<0.05),而其他浓度(5 μmol/L或30 μmol/L)姜黄素未见明显影响.结论 一定浓度的姜黄素可以影响AMPA/KA受体介导大鼠海马神经元钙内流.这可能是姜黄素抗癫痫作用的一个机制.     

GSI对机械性损伤的神经元保护作用

目的探讨γ-分泌酶抑制剂(GSI)对神经元机械性损伤的保护作用。方法原代培养小鼠皮层神经元,培养基中加入10μmol/L GSI共同孵育24 h后,使用微量移液器枪头做机械性划伤。测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力的变化;Hochest染色测定神经元凋亡情况;Western blot方法检测切冬酶-3(caspase-3)蛋白表达情况。结果 GSI预处理可抑制因细胞损伤引起的LDH的释放,可降低损伤后Hochest阳性细胞的数量以及活化caspase-3的表达。结论 GSI对神经元机械性损伤有保护作用。     

ADDLs对原代培养小鼠皮层神经元及星形胶质细胞混合培养体系Notch-1信号转导及HIF-1α表达的影响

目的探讨Aβ寡聚体(ADDLs)对原代培养小鼠皮层神经元及星形胶质细胞混合培养体系Notch-1信号转导及HIF-1α蛋白表达的影响。方法在原代培养小鼠皮层神经元及星形胶质细胞混合培养体系的基础之上应用CCK-8法观察Aβ寡聚体对混合培养体系细胞活力的影响,并应用免疫印迹的方法检测Aβ寡聚体对混合培养体系的NICD及HIF-1α水平的影响。另外,应用qPCR的方法检测凋亡相关caspase-3mRNA水平。结果 Aβ寡聚体干预浓度在高于2μM的情况下可使混合培养体系细胞活力水平明显降低,并呈现浓度依赖。10μM的ADDLs明显升高了原代混合培养体系的NICD及HIF-1α蛋白表达水平,且均呈现出相对的时间依赖性,同时这两种蛋白表达水平的变化表现出基本一致的趋势。同时,10μM的ADDLs明显上调了混合体系的caspase-3 mRNA水平。结论 Aβ寡聚对原代培养小鼠皮层神经元及星形胶质细胞混合培养体系的毒性作用与上调NICD及HIF-1α表达水平密切相关。     

原代培养的皮质神经元缺血性损伤模型的建立

目的建立方便有效的神经元拟缺血性损伤的离体模型。方法以原代培养Wistar大鼠乳鼠大脑皮层神经元为研究对象,不同浓度H2O2及Glu与细胞作用24h后,检测细胞活力,LDH漏出量及细胞形态学改变。结果6．25μmol/L～200μmol/L H2O2及12．5μmol/L～50μmol/L Glu均可降低神经元生长能力,增加乳酸脱氢酶漏出量；细胞形态有不同程度病理变化。结论H2O2与Glu引起的细胞损伤模型是两种方便有效的神经元拟缺血性损伤模型。     

巴曲酶对NJS小鼠短暂性脑缺血发作后神经细胞的保护和改善认知功能的作用

目的 观察巴曲酶对小鼠短暂性脑缺血发作（TIA）后神经细胞的保护和改善认知功能的作用。方法 选择自发性高胆固醇血症小鼠56只，分为对照组（缺血发作但未用药），缺血前2小时用药组，缺血后2小时用药组，缺血后24小时用药组。缺血后72小时测定各组小鼠的认知行为学指标和海马CA1区神经元凋亡数。结果 缺血前2小时用药组和缺血后2小时用药组神经元凋亡数较对照组少，认知功能恢复好于对照组，缺血后24小时用药组各指标与对照组相比无统计学差异。结论 巴曲酶对小鼠TIA后神经元有保护作用和促进认知功能恢复，但应早期用药。     

一种C-Jun N-末端激酶肽抑制剂在沙土鼠全脑缺血中的保护作用

目的 为了进一步研究海马C1区域神经细胞活动中JNK的作用，我们评价了一种JNK抑制剂即D-JNKI1在沙土鼠一过性大脑缺血模型中对迟发性神经细胞死亡（DND）的作用。方法 55只沙土鼠随机分为11个组。5组沙土鼠先接受5min前脑缺血处理，再灌注3h后，通过立体定向方法。向每组沙土鼠右侧侧脑室内分别注入不同浓度的D-JNKI1（2μL PBS内加入0．00012，0．0012，0．012，0．12，1．2μmol／L D-JNKI1，每组n=5）。对照组（n=5）：沙土鼠先接受5min前脑缺血处理，再灌注3h后，通过立体定向方法方法向右侧侧脑室内仅注入PBS2μL。腹腔内注射组（n=5）沙土鼠；先接受5min前脑缺血处理，再灌注3h后，1．2μmol／L D-JNKI1溶于0．5mL PBS腹腔内注射。假手术组（n=5）；沙土鼠仅暴露双侧颈总动脉，未夹闭。预处理组（共3组，n=15）：先将0．0012μmol／L D-JNKI1，0．00012μmol／L D-JNKI1溶于2μL PBS，分别注入两组沙土鼠的右侧侧脑室内，另外一组沙土鼠的右侧侧脑室内仅仅注入PBS2μL，30min后三组均夹闭双侧颈总动脉2min，48h后再次接受双侧颈总动脉夹闭5min。所有沙土鼠从接受夹闭5min双侧颈总动脉后4d处死，作冰冻切片和Niss1染色。结果 缺血再灌注3h后用D-JNKI-1治疗，有神经保护作用，最好的神经保护效应浓度为0．0012μmol／L。D-JNKI-1预处理加强了2min预处理所诱导的缺血耐受效应。结论D-JNKI1在沙土鼠全脑缺血模型中对海马CA1区域的迟发性神经细胞死亡有潜在的神经保护作用。