HPV16 E6基因特异性RNA干扰表达载体的构建及对HPV16 E6基因抑制作用的研究

目的:构建针对HPV16 E6基因的RNA干扰表达载体,并研究其对宫颈癌HPV16 E6基因的抑制作用。方法:针对HPV16 E6基因序列设计shRNA(short hairpin RNAs,shRNAs)片断,构建针对HPV16 E6基因的RNA干扰(RNA interference,RN Ai)质粒表达载体,脂质体法转染宫颈癌Caski细胞株,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对HPV16 E6 mRNA及蛋白表达的影响。结果:经PCR及测序证实3种表达载体构建成功,细胞试验表明3种表达载体均抑制了HPV16 E6的mRNA及蛋白的表达,其中CaskiB细胞HPV16E6mRNA的抑制率为89.5%,蛋白抑制率达98.1%。结论:RNAi表达载体可以有效的抑制HPV16 E6基因的表达。     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317，G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa，G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达，HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

HPV-16 E6基因沉默对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的: 研究特异性抑制HPV E6基因的表达对宫颈癌CaSki细胞的影响. 方法: 构建表达HPV-16 E6基因siRNA重组质粒,体外转染CaSki细胞后检测E6 mRNA表达变化及E6主要作用靶分子P53的蛋白变化;流式细胞术分析细胞周期. 结果: 特异RNAi表达质粒转染CaSki细胞后明显降低了E6 mRNA水平,且P53蛋白水平增高. 流式细胞仪测定发现细胞停滞在G0-G1期,细胞增殖受到抑制. 结论: 采用RNA干扰技术能沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因的表达,使细胞中抑癌蛋白P53水平增高,导致肿瘤细胞生长停滞.     

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。     

siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响.方法: 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E6 mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化.结果: HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成.结论: HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成.     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

慢病毒介导RNA干扰Clusterin基因表达载体的构建及其在肾癌786-O与ACHN细胞系中的表达

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立Clusterin(CLU)基因稳定干扰的人肾癌细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础.方法:以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体连接真核表达载体.另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒.利用包装细胞293T获得重组慢病毒,分别感染人肾癌786-O细胞株及ACHN细胞株.应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别CLU表达的变化.结果:成功构建CLU shRNA慢病毒载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度＞4×1011TU/L.Real Time-PCR、Western blot结果显示干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低.结论:慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.     

The inhibitory effects of siRNA expression vector on CXCR4 expression in prostate carcinoma cell lines

INTRODUCTION Ithasbeendemonstratedthatchemokinesandtheirreceptorsarecloselyrelatedtomalignantbehavior oftumorcells.Especially,thechemotaxiscausedby CXCR4anditsligandstromalcellderivedfactor1(SDF1)inthetumorcells,suchasleukemiacells,lungcarcinomacellsandovarycarcinomacells,isthe mostinteresting[13].Ithasalsobeenindicatedthat CXCR4isexpressedinmanykindsofnasopharyngeal carcinomacellsandprostatecarcinomacells[46].CXCR4andSDF1canalsobeexpressedsimultaneouslyinsome kindsoftumorcells.The…     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的构建RNAi表达载体,并分析其对胰腺癌细胞PANC-1 survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,并把survivin基因克隆到T载体进行测序,构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1,RT-PCR、western-blot分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达,其基因序列与GenBank中公布的一致,干扰载体pTZU6＋1-svv2可以有效的抑制survivin的表达,抑制率约为74％,并诱导了肿瘤细胞的凋亡。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达并诱导胰腺癌细胞凋亡。     

靶向人RIP RNAi真核表达载体构建及在人肝癌细胞Huh7细胞中的表达

目的:构建靶向人RIP的小分子干扰RNA(siRNA)真核表达载体(pSUPERpuro-RIP),在Huh7细胞系中瞬时表达后,检测其对RIP的沉默效果。方法:设计4对含RIP mRNA特异性序列的60 nt DNA链,通过基因克隆技术将其插入真核表达载体pSUPER-puro,构建重组pSUPERpuro-RIP siRNA载体,以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序验证其正确性。再瞬时转染Huh7细胞,Western blot检测RIP蛋白表达。结果:酶切测序证实载体构建成功,无碱基突变。Western blot结果表明pSUPERpuro-RIP siRNA在Huh7细胞系中有较好的沉默效果。结论:成功构建了靶向人RIP基因的siRNA载体pSUPERpuro-RIP siRNA。     

Survivin干扰RNA载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:探索合成survivin siRNA和RNAi载体的构建,及其在HEK293细胞中的表达?方法:分别采用化学合成的针对survivin的siRNA和shRNA载体(pGCsi载体),转染HEK293细胞后观察HEK293细胞中survivin的RNA及蛋白表达?结果:不同序列的siRNA和shRNA转染入HEK293细胞后,survivin的RNA及蛋白表达出现不同程度的下降?结论:化学合成与shRNA载体均可有效抑制HEK293细胞的survivin基因表达,为利用survivin作为靶点治疗胰腺癌等恶性肿瘤提供了技术基础?     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达的实验研究

目的研究用RNAi表达载体对胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,并把survivin基因克隆到T载体进行测序,构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC一1,RT-PCR初步分析干扰载体对survivin表达地抑制情况。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达,其基因序列与genebank中公布的一致,干扰载体si-svv-2可以有效的抑制survivin的表达,抑制率达71％。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达。     

Rictor基因特异性RNA干扰表达载体的构建和筛选

目的构建针对Rictor基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人膀胱癌T24细胞,观察其对目的基因Rictor表达的影响,为探讨沉默Rictor基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响奠定基础。方法根据GENEBANK提供Rictor基因系列,设计并化学合成三对Rictor-RNAi和一对阴性对照寡核苷酸序列,定向克隆入真核质粒载体pGCSIL-PUR中,构建pGCSIL-RICTOR-RNAi表达载体。各质粒载体瞬时转染到T24细胞,Western-Blot检测筛选载体。筛选出的载体稳定转染,Realtime-PCR和Western-Blot筛选干扰效果明显的稳定株。结果重组质粒pGCSIL-RICTOR-RNAi经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,成功构建Rictor-RNAi载体。瞬时转染T24细胞,RICTOR蛋白表达明显降低。稳定转染T24细胞,Rictor基因表达在mRNA水平和蛋白水平均明显降低。结论成功构建Rictor-RNAi表达载体,转染T24细胞后可有效抑制Rictor表达。