TRAIL的抗肝细胞癌作用研究

目的 探讨TRAIL对HCC的治疗作用。方法 用不同浓度TRAIL处理肝癌细胞株HepG2、SMMC7721，观察经药物处理前后肿瘤细胞的凋亡发生率。采用分子克隆技术构建了真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL，转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞，观察其疗效。体内实验建立裸鼠肝癌模型，观察TRAn。的抑癌作用。结果TRAR，(100ng／m1)处理24h，肝癌细胞凋亡发生率约10％，而Jurkat细胞凋亡率达70％以上，胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射pIRES-EGFP-TRAIL可有效的导入TRAIL基因并获得高表达，但对裸鼠肝癌无明显抑制作用。结论 肝细胞癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象，提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素，单一的TRAIL疗HCC疗效有限。     

Angiostatin基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的:研究Angiostatin基因治疗对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相关机理。方法:使用人原发性肝癌细胞株SMMC-7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,质粒用脂质体DOTAP介导转染细胞。将荷瘤裸鼠随机分为两组,分别注射质粒PcDNA3、Angiostatin/PcDNA3,观察两组动物的肿瘤生长曲线,检测肿瘤的Angiostatin、VEGF、HIF-1α表达和微血管密度(MVD),利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。结果:Angiostatin基因治疗在早期具有抑制肿瘤生长的作用,大约1周后肿瘤以更快的速度生长并迅速赶上空质粒对照组肿瘤;Angiostatin基因治疗组的肿瘤组织中有An-giostatin的局部高表达,MVD(24.8±2.8)低于空质粒对照组(30.2±4.1)(P〈0.05)。肿瘤组织中HIF-1α蛋白局部高表达,VEGF表达高于空质粒对照组,细胞凋亡指数(2.87±0.48)高于空质粒对照组(1.55±0.43)(P〈0.01)。结论:Angiostatin基因治疗对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有一定的抑制作用,肿瘤对Angiostatin基因治疗可以产生耐受性。     

RNA干扰技术靶向SMYD3基因治疗肝癌的实验研究

目的 构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3（SMYD3）编码基因的短发夹状RNA（shRNA）干扰质粒,并研究其对肝癌细胞的作用。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测SMYD3mRNA在肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC7721的表达。构建重组SMYD3shRNA表达质粒Pgenesil-1-s,并采用介导转染法导入HepG2细胞,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测阻抑效应,噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。建立人肝癌细胞HepG2皮下移植瘤裸鼠模型,注射Pgenesil-1-s,动态观察肿瘤体积并于2周后处死裸鼠称取瘤重。结果肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC7721的SMYD3mRNA表达水平显著高于正常肝细胞株L-02;Pgenesil-1-s转染HepG2细胞后,SMYD3蛋白表达明显下调,而且细胞凋亡率显著增加,细胞生长明显受抑;经重组质粒治疗14d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小、瘤重明显减轻（P〈0．01）。结论 肝癌细胞高表达SMYD3,shRNA干扰特异性抑制SMYD3表达,可以促进肝癌细胞凋亡并抑制裸鼠移植瘤的生长。     

RNA干涉胰岛素样生长因子1类受体的研究

RNAi技术的关键是siRNA的制备，实验结果证实，通过发卡结构的小RNA（shRNA）载体表达siRNA可以抑制特定靶基因表达。我们通过将针对IGFIR基因的RNA干扰片段装入特定质粒PSUPER中，再转染入人肝癌细胞株SMMC7721中，并筛选出稳定株。     

PTEN真核表达质粒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制效应

目的:探讨PTEN真核表达质粒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法:将人膀胱癌细胞株BIU-87裸鼠背部皮下接种,成瘤后于瘤内多点注射重组真核表达质粒pBp-PTEN,设pBp空质粒和生理盐水为对照,观察肿瘤生长情况、PTEN表达的变化。结果:pBp-PTEN治疗组肿瘤变小,PTEN表达阳性率提高,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PTEN真核表达质粒pBp-PTEN瘤内注射对人膀胱癌裸鼠移植瘤有一定的抑制作用。     

反义HIF-1α基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

摘要：目的:探讨反义HIF-1α基因对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的影响及其相关机制。方法:使用人原发性肝癌细胞株SMMC-7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。待肿瘤生长至直径约0.4cm时，将荷瘤裸鼠随机分为3组，分别注射生理盐水、质粒PcDNA3和HIF-1α/PcDNA3B，质粒用脂质体DOTAP介导转染细胞。观察各组动物的肿瘤生长曲线；取肿瘤标本作免疫组织化学检查（SABC法）及蛋白质印迹检查，检测各组肿瘤的VEGF和HIF-1α表达及微血管密度（MVD）和细胞凋亡。结果:HIF-1α/PcDNA3B治疗组各时点的肿瘤体积，以及肿瘤组织中HIF-1α蛋白、MVD，VEGF表达均低于对照组，而细胞凋亡指数高于对照组，差异均有显著性（P＜0.05）。结论:通过阻断癌细胞的缺氧适应途径，反义HIF-1α基因治疗肝癌有抑制肿瘤生长、抑制肿瘤血管生成及诱导细胞凋亡的作用。     

siRNA封闭胰岛素样生长因子Ⅰ类受体对肝癌细胞侵袭能力的影响及其机制

目的 探讨人胰岛素样生长因子1类受体(IGFIR)的短发夹环RNA质粒(pSUPER-siRNA-IGFIR)能否有效抑制人肝癌细胞株MHCC97H侵袭能力并探讨其相关机制.方法 设计并合成靶向IGFIR的siRNA片段并构建Psuper-siRNA-IGFIR表达质粒,将其转入MHCC97H、SMMC7721细胞,通过G418筛选出稳定株.通过黏附实验、Boyden小室实验、软琼脂克隆形成实验观察各细胞株侵袭能力的变化并采用明胶酶法测定肝癌细胞的金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的含量,Western blot检测增殖相关基因的变化.并设空白对照组、阳性对照组.结果 MHCC97H-IG-FIR-siRNA、SMMC7721-IGFIR-siRNA黏附能力比对照组下降约5倍(MHCC97H)和6倍左右(SMMC7721),细胞迁移能力明显下降,下降各约3倍,细胞克隆形成率明显低于对照组约6倍和8倍,其MMP-2、MMP-9、ICAM-1、LNR、E-cadherin表达比对照组低.结论 构建的pSUPER-siRNA-IGFIR具有RNA干扰作用,可抑制肝癌细胞株转移能力.     

逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因对人肝癌细胞体内生长的抑制作用

目的：探讨宿主细胞表达的人血管内皮抑制素（endostatin)对人肝癌细胞在体内生长的影响。方法：利用逆转录病毒载体pLncx,将endostatin基因导入人肝癌细胞SMMC7721内建立转基因肝癌细胞株。应用PCR、免疫组化及Western blot检测人endostatin的转染、表达和分泌。血管内皮细胞增殖试验检测表达的endostatin生物学活性。同时对转染细胞株在体外及在裸鼠体内的生长情况进行观察。结果：PCR证实,转endostatin基因的肝癌细胞 基因组中存在有550bp人特异性endostatin片段,免疫组化及Western blot印迹分析示人endostatin在转染肝癌细胞株中获得稳定表达和分泌。转染细胞表达的endostatin能显著抑制人血管内皮生长,抑制率达48％（P＜0．01）。与对照组相比,转染人endostatin基因的肝癌细胞在体外的生长速度无明显改变,但在接种裸鼠皮下后,肿瘤生长明显受到抑制,在22d时,肿瘤缩小率达94．5％（P＜0．01）。结论：逆转录病毒介导的人endostatin基因疗法对人肝癌SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著抑制作用。     

促血管生成素基因转染对人肝癌细胞成瘤性和血管生成的影响

目的 观察促血管生成素—2(Angiopoietin-2)基因转染人肝癌细胞系SMMC7721后对其体外成瘤性和血管生成的影响，进一步研究促血管生成素—2在肝癌血管生成和转移中的作用。方法 选择本身不表达Angiopoietin-2的肝癌细胞系SMMC7721，通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin-2基因导入SMMC7721肝癌细胞系，并用G418筛选稳定表达的细胞克隆，用RT—PCR和免疫荧关法检测是否成功构建了携带Angiopoietin-2基因并稳定表达的SMMC7721肝癌细胞系。将30只裸鼠随机分成两组，分别用未转染和转染了Angiopoietin-2基因的SMMC7721肝癌细胞注射于裸鼠皮下产生肿瘤结节，观察肿瘤生长的速度并对肿瘤组织中的微血管进行检测。结果 用RT—PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均可以证实新构建的肝癌细胞系携带了Angiopoietin-2基因并能稳定表达其蛋白产物。表达Angiopoietin-2基因后肿瘤生长速度明显加快，肿瘤组织中血管生成的数量较未转染前明显增多。结论 促血管生成素—2的表达增强了人肝癌细胞系SMMC7721的体外成瘤性并促进了肿瘤组织中的血管生成。促血管生成素可能参与了肝癌的新生血管形成的过程。     

人甲胎蛋白增强子驱动自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷自杀基因系统体内外靶向杀伤肝癌细胞的效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒;利用脂质体将质粒转染入AFP阳性肝癌细胞株HcpG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721;采用RT-PCR和Western blot检测TK mRNA和蛋白表达;MTT检测细胞的存活率;观察丙氧鸟苷对肝癌细胞体外增殖、生长曲线和细胞凋亡的作用,以及丙氧鸟苷体内抑制肿瘤生长的效应.采用t检验分析相关数据.结果 成功构建pAFP-cDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒并转染入肝癌细胞;AFP阳性肝癌细胞株HepG2中能检测到TKmRNA和蛋白表达;丙氧鸟苷呈剂量和时间依赖性抑制转染后肝癌细胞株HepG2的生长并诱导其凋亡;AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721中没有TKmRNA和蛋白表达,细胞增殖、生长曲线和凋亡均不受影响,两者比较,差异有统计学意义(t=2.58,2.73,3.12,P＜0.05).丙氧鸟苷可以特异性地抑制转染后肝癌细胞株HepG2治疗组中肿瘤的生长,肿瘤抑制率为46%,而在转染后肝癌细胞株SMMC7721治疗组中,对肿瘤生长无明显抑制作用,两者比较,差异有统计学意义(t=3.36,P＜0.05).结论 人AFP增强子驱动的HSV-TK/丙氧鸟苷自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞,抑制肿瘤生长.     

内皮抑素基因对鼠移植性肝癌抑制作用的实验性研究

目的:探讨血管内皮抑素endostatin对体内人肝癌细胞在体内的影响。方法:将以pcDNA3.1为载体的鼠源性endostatin基因转染人肝癌细胞SMMC7721建立的裸鼠的肝癌模型。应用免疫组化和Westernblot检测endostatin的转染和表达。用免疫组化计数肿瘤血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的阳性率。同时观察转基因肿瘤的生长情况。结果:可见endostatin在肝癌细胞的稳定表达和分泌,其MVD显著低于对照组(P<0.05),VEGF同对照组比较差异亦有显著性(P<0.05)。结论:en-dostatin基因对人肝癌细胞SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著的抑制作用,endostatin能减慢肿瘤生长速度,但不能完全消除肿瘤。     

Fe2O3纳米磁流体热疗治疗肝癌

目的　研究在一定高频交变磁场不同浓度的Fe2 O3 纳米磁流体热疗对SMMC772 1肝癌的治疗作用。方法　光学显微镜、电子显微镜观察细胞形态 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT )比色法检测Fe2 O3 纳米磁流体热疗 (MFH)对SMMC772 1肝癌细胞株生长的影响 ,流式细胞仪 (FCM )检测凋亡细胞 ,荷瘤鼠热疗实验检测MFH对肝癌的肿瘤体积抑制率及质量抑制率。结果　SMMC772 1细胞经Fe2 O3 纳米磁流体热疗作用后 ,细胞增殖受到明显抑制 ,细胞凋亡率明显增加 ,且与磁流体浓度呈依赖关系 ;动物实验显示纳米磁流体热疗对肝癌的体积和质量有明显的抑制作用。结论　Fe2 O3 纳米磁流体热疗能抑制肝癌SMMC772 1细胞增殖 ,促进其凋亡 ,并对肝癌显示明显的体积和质量抑制效应 ,对肝癌的治疗有一定的作用。     

甲胎蛋白启动子驱动的yCDglyTK双自杀基因治疗裸鼠肝癌的机制研究

目的研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内靶向性治疗肝癌的效果和机制。方法构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因表达质粒,通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721肝癌细胞的裸鼠肝癌皮下种植瘤,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果成功构建携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因,其靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞种植瘤上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞种植瘤上无表达,氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及两者联合可有效抑制HepG2细胞种植瘤的生长,抑瘤效果GCV＋5-FC〉5-FC〉GCV,而SMMC7721细胞种植瘤的生长未受影响。HepG2细胞种植瘤治疗后有明显的细胞凋亡,而SMMC7721细胞种植瘤内极少凋亡细胞。结论携带AFP启动子的yCDglyTK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

下调CD133表达对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨下调CDl33基因的表达对肝癌细胞生物学行为的影响。方法:将合成的CDl33小干扰核糖核酸分子(si RNA)转染至肝癌SMMC7721细胞并检测转染效率;分别以无转染与转染随机si RNA序列的SMMC7721细胞为空白对照和阴性对照,观察CDl33 si RNA转染后CDl33基因沉默效果,以及SMMC7721细胞主要生物学行为的变化。结果:转染24 h后,转染效率可达到(80.8±9.1)%;与空白对照组比较,CDl33 si RNA转染后的SMMC7721细胞CD133 m RNA及蛋白表达量分别降至空白对照组的10%与35%、细胞增殖活性明显降低、细胞凋亡率明显增加(41.3%vs.25.3%)并出现明显的S期阻滞,集落形成能力明显降低(均P0.05)。阴性对照组与空白对照组各指标无统计学差异(均P0.05)。结论:CDl33在肝癌细胞中可能起了癌基因作用,下调其表达能抑制肝癌的恶性生物学行为。     

靶向β-catenin短发夹RNA抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的探讨靶向β—catenin的短发夹RNA（shRNA）对人结肠癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法构建两个靶向β—catenin的短发夹RNA的质粒载体CAT1、CAT2和阴性对照质粒Neg,并将其转入人结肠癌Colo205细胞,分组种植到裸鼠皮下以建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型。随后观察监测各组裸鼠的肿瘤生长情况。第8周裸鼠处死并剥离出肿瘤组织,HE染色观察肿瘤细胞的形态,免疫组化方法检测β—catenin蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果各组裸鼠的内脏未受到明显的毒害和损伤。第8周CAT1、CAT2实验组裸鼠移植瘤的体积和质量与空白对照组相比均有显著性缩小（P〈0．05）,抑制率大约在50％左右。而且与空白对照组相比,CAT1、CAT2组移植瘤的β—catenin表达均有显著性下调,肿瘤细胞凋亡指数均有显著性的升高（P〈0．05）。阴性对照组的上述指标与空白对照组相比差异均无统计学意义。结论所构建的靶向β—catenin的短发夹shRNA能够抑制人结肠癌Colo205细胞裸鼠移植瘤的生长,为结肠癌基因治疗开辟新的思路。     

TRAIL真核表达质粒的构建及抑制肝癌生长的实验研究

目的构建TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的真核表达质粒，观察其对BALB／c裸鼠肝癌细胞皮下移植瘤模型的抑瘤作用。方法提取U937细胞总RNA．用RT-PCR方法扩增出胞外区(114—281aa)，连入溶菌酶信号肽序列，构建分泌型TRAIL重组质粒；建立裸鼠7402肝癌细胞皮下移植瘤模型，纯化后的质粒DNA与脂质体聚乙烯胺混合后经肌肉注射进行基因转染，体内验证重组蛋白的抑瘤活性，采用TUNEL法进行肿瘤组织细胞凋亡检测。结果肿瘤体积测定结果显示．TRAIL对肝癌细胞生长有抑制作用；凋亡检测光镜下可见有棕褐色凋亡细胞，细胞凋亡指数增高。结论重组TRAIL质粒能引起肿瘤细胞的凋亡，抑制7402肝癌细胞的生长。     

组织因子途径抑制物2基因对Panc-1细胞裸鼠成瘤及转移的影响

目的观察组织因子途径抑制物2（TFPI-2）对胰腺癌细胞系Pane-1细胞裸鼠成瘤及转移的影响。方法将Pane-1-TFPI-2细胞接种到裸鼠皮下作为实验组，观察肿瘤生长情况并测量其大小；取皮下新生肿瘤组织进行原位胰腺接种，观察其对周围组织浸润及远处转移能力的影响。同时以Pane-1-V和Pane-1-P细胞作为对照组。结果实验组和对照组裸鼠皮下均成瘤，但实验组肿瘤体积小于对照组，分别为（438．0±69．8）、（852．0±102．9）和（831．0±78．1）mm’，差异有统计学意义（P〈0．05）。原位胰腺接种，对照组移植瘤浸润胰腺组织，有肝、肺、淋巴结及腹膜转移灶形成，免疫染色显示转移灶CEA阳性，证实其为胰腺肿瘤转移而来。实验组移植瘤包膜完整，无明显浸润及转移现象。结论TFPI-2能抑制肿瘤细胞生长、周围组织浸润及远处转移，为胰腺癌的基因治疗奠定了实验基础。     

肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

目的探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响。方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒。针对已经筛选确定的IGF1R基因干扰有效序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R质粒。RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。用sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R, psPAX2, pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度。RT-PCR、Westernblot检测IGF1R表达,竞争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性。CCK-8法检测细胞生长。结果成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R;滴度为4.58×109PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R抑制了肝癌细胞IGF1R表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长。结论本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路。