NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株的特异性杀伤作用

目的：探讨肿瘤睾丸抗原NYESO1（New Yorkesophageal1）致敏树突状细胞体外诱导特异性CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。方法：重组质粒pGEXESO1经原核诱导表达并纯化GSTESO1融合蛋白肽。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）和白细胞介素4（rhIL4）诱导培养人外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DCs）,经GSTESO1融合蛋白肽致敏后诱导特异性CTL增殖。以此CTL为效应细胞,分别以NYESO1阳性表达的肝癌细胞株HepG2和不表达NYESO1的肝癌细胞株H2P为靶细胞,MTT法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。结果：重组质粒pGEXESO1经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达相对分子质量约36 000的GSTESO1融合蛋白肽,纯化后的质量浓度为50 μg/ml;经rhGMCSF和rhIL4联合诱导成功培养人外周血DCs,其表型分子HLADR为91.4%、CD86为70.5%、CD83为71.2%、CD80为55.3%。NYESO1致敏的DCs能明显诱导CTL增殖,此CTL对肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著高于GST刺激组、未致敏DC组和无DC刺激组(均P<0.05),效靶比为50∶1时杀伤效应达到最高峰\[(53.23±3.78)%,P<0.01\];相同条件下CTL对H2P细胞无特异性杀伤作用。结论： NYESO1抗原致敏的DCs在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对NYESO1阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗提供了一条新思路。     

肝癌细胞抗原致敏树突状细胞诱导的体外抗肿瘤作用

目的　探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞 (DC)经自体肝癌细胞抗原致敏后诱导的体外抗肿瘤作用。方法　对肝癌患者外周血采用密度梯度离心法分离 ,获得DC前体细胞 ,用重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白细胞介素 4(rhIL 4)联合培养 ,诱导扩增DC。制备自体肝癌细胞抗原 ,体外脉冲DC ,检测DC诱导自体T细胞增殖能力及细胞毒性T细胞 (CTL )在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性 ,并检测肿瘤抗原致敏DC分泌的IL 12水平。结果　经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能分泌IL 12和诱导较强的自体T细胞增殖 ,且能诱导特异性CTL ,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性 ,杀伤率显著高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率 ,而对CT 2 6细胞、BEL 740 2细胞无明显的杀伤作用。结论　肝癌患者外周血DC经自体肝癌细胞抗原致敏后能诱导高效而特异的抗肝癌免疫 ,其机制可能与增强T细胞应答和诱导机体产生肿瘤特异CTL从而发挥特异性的抗肿瘤作用有关。     

CB6F1小鼠树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用

[目的]探讨CB6F1小鼠脾树突状细胞(DC)的培养及其诱导针对小鼠路易斯肺癌(LLC)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤的杀伤效应.[方法]应用CB6F1小鼠脾细胞在GM-CSF、IL-4等细胞因子作用下培养出DC,反复冻融法制备LLC抗原致敏DC,与淋巴细胞及IL-2混合培养诱导出肿瘤特异性CTL,利用乳酸脱氢酶法检测CTL的杀伤活性.[结果]用GM-CSF、IL4联合培养小鼠脾细胞第4d,可见细胞形态发生改变,培养第8d,可见典型的刺突样DC,通过流式细胞术检测了DC表型高表达CD80占76.5％,CD86占60.0％,MHCⅡ占67.4％,CD11C占80.6％.[结论]应用GM-CSF、IL-4、LPS等细胞因子培养CB6F1小鼠脾细胞经过肿瘤抗原冲击,可以培养出成熟DC,并且DC可以诱导出具有杀伤活性的肿瘤特异性CTL.     

含甲胎蛋白肽段的重组腺病毒转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对肝癌细胞的体外杀伤效应

目的 研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)转染含甲胎蛋白(AFP,137-145)片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的体外杀伤作用.方法 抽取健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含AFP片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC,诱导特异性T细胞.检测体外培养的DC和细胞毒性T细胞(CTL)活性,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用.结果 转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86和IL12,成熟DC诱导的CTL高表达IFNγ;修饰成熟后的DC后体外能诱导特异性CTL,该CTL在休外对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721均有杀伤作用.结论 重组腺相关病毒转染DC,不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖和分化功能,可诱导自体CTL增殖,含AFP(137～145)片断的腺相关病毒转染DC诱导自体CTL对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞有明显杀伤作用,DC疫苗可以作为肝癌患者免疫治疗的有效补充.     

MGBA负载脐带血DC诱导特异性CTL对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的：观察乳腺珠蛋白（mammaglobin A, MGBA）负载脐带血来源树突状细胞（dendritic cell, DC）诱导产生的细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）对乳腺癌细胞的体外杀伤效果。方法：采集健康剖宫产女性志愿者的脐带血,分离脐带血单个核细胞并诱导DC生成,用MGBA致敏DC与自体淋巴细胞共培养诱导CTL。采用流式细胞术测定DC的表型(CD83、CD86、HLADR)变化,ELISA法测定IL-10、IL-12分泌水平,CCK-8法测定CTL对乳腺癌细胞的杀伤活性。结果：成功培养出形态典型、功能成熟的DC,MGBA负载DC诱导的MGBA特异性CTL对乳腺癌细胞MDA-MB-415 产生显著的杀伤效果（P<0.05）;加入HLA-I 抗体可显著减弱杀伤效果,加入HLA-II 抗体细胞毒活性无显著变化,加入HLA-I 抗体或HLA-II 抗体对正常乳腺细胞的杀伤性均无影响。结论：MGBA 能明显加强脐带血DC 诱导的CTL 对乳腺癌细胞的杀伤活性,该杀伤活性具有MHC限制性。     

胶质瘤细胞来源的exosome负载树突状细胞诱导肿瘤特异性杀伤的研究

背景与目的：对于各种恶性肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞疫苗研究目前已成为全球抗肿瘤治疗的热门话题。本研究旨在观察胶质瘤细胞来源外来体致敏的树突状细胞,诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤胶质瘤细胞的活性。方法：采用差速离心法分离胶质瘤细胞分泌的外来体,制备胶质瘤冻融抗原;从胶质瘤患者外周血中获取单状核细胞和T淋巴细胞,培养并获取树突状细胞;将胶质瘤来源的外来体、胶质瘤冻融抗原分别冲击树突状细胞并与T淋巴细胞混合培养．通过MTT法检测两种方法制备的效应细胞对胶质瘤细胞的杀伤效应。结果：当效靶比分别为10：1、25：1、50：1时,冻融抗原-DC＋T细胞对恶性胶质瘤细胞杀伤率为（17．50±1．13）％、（21．18±1．36）%、（30．20±1．46）％。外来体-DC＋T细胞组对恶性胶质瘤细胞杀伤率分别是（32．25±1．36）％、I（43．04±1．22）％、（70．42±1．40）％,二者杀伤力的差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：胶质瘤细胞来源的外来体致敏树突状细胞,其特异性杀伤胶质瘤细胞的能力明显优于胶质瘤冷冻抗原。     

小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞对特异性CTL的体内外诱导作用

目的 探讨白细胞介素-12(IL-12)诱导小鼠红白血病细胞产生的树突状细胞,对白血病特异性CTL细胞的诱导作用,及体内免疫后对抗肿瘤免疫应答的诱导效果.方法:采用4/小时~(51)Cr释放法,检测CTL杀伤活性;观察小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞体内免疫冶疗后对肿瘤的抑制作用,采用了HE染色和电镜等技术,分析肿瘤组织的病理学变化.结果:IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC,在体外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL.采用IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC免疫C57 BL/6小鼠.体内诱导出的CTL杀伤活性明显高于对照组.实验组小鼠能够有效的抵抗野生型FBL-3细胞的再攻击;肿瘤生长受到明显的抑制,组织学观察显示,肿瘤局部有较多炎性细胞浸润和细胞坏死;透射电镜可观察到典型的凋亡征象,结论:IL-12诱导小鼠FBL-3红白血病细胞产生的树突状细胞,在体内外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL,体内免疫后可增强抗肿瘤免疫应答,该结果为白血病的免疫治疗提供了新的途径.     

抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

[目的]探讨抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导CIK（cytokine induced killer）的杀伤作用。[方法]联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4（IL-4）从外周血单个核细胞中培养DC，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC，流式细胞仪检测致敏前后DC表型的变化，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC诱导CIK，用MTT法检测淋巴细胞的增殖及原致敏DC诱导CIK对SGC的杀伤效应。[结果]①利用GM-CSF及IL-4可从外周血单个核细胞中获取DC，肿瘤抗原可促进DC的成熟，肿瘤抗原致敏可促进DC成熟，细胞表面分子HLA-DR、CD86、CD86升高，CD14下降。②混合淋巴细胞反应提示成熟的DC可促进CIK细胞增殖。③SGC肿瘤抗原致敏DC诱导CIK对胃癌细胞SGC有特异性的杀伤作用，随着效靶比的升高，杀伤效应随之增强。[结论]抗原致敏的DC可通过诱导特异性CIK细胞及促进CIK细胞增殖两方面显著提高CIK细胞的杀瘤效应。     

树突状细胞体外高效诱导白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞生成

[目的]研究体外诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及其抗白血病反应.[方法]应用mGM-CSF及mIL-4细胞因子从小鼠骨髓细胞扩增出成熟树突状细胞(DC),使其负载冻融法制备的白血病细胞相关抗原(TAA),通过观察DC诱导的白血病特异性CTL的免疫表型,MTT分析其对于L7212细胞的抑制率,利用ELISA评价IL-2和IL-4水平.[结果]骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4的联合作用7天后光镜及扫描电镜下观察到大量成熟DC生成.经负载TAA的DC活化后T细胞中CD3 、CD8 、CD25 细胞明显增多.FCM显示CD3 、CD8 、CD25 T细胞显著增多,CD8 细胞多于CD4 细胞.活化后T细胞对L7212细胞有特异性杀伤活性,在效靶比为50:1培养72 h后杀伤率达90.1%±2.7%.DC与T细胞共培养上清中IL-2的分泌水平为4.656±0.62pg/ml,明显高于普通T细胞培养组的1.436±0.11pg/ml(P=0.011),IL-4水平则无明显变化(P＞0.05).[结论] mGM-CSF及mIL-4配伍诱导生成的DCs经L7212冻融抗原负载后可在体外高效诱导白血病特异性CTL生成.     

小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞对特异性CTL的体内外诱 …

目的 探讨白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）诱导小鼠红白血病细胞产生的树突状细胞,对白血病特异性ＣＴＬ细胞的诱导作用,及体内免疫后对抗肿瘤免疫应答的诱导效果。方法：采用４小时＾５１Ｃｒ释放法,检测ＣＴＬ杀伤活性;观察小鼠红白细胞病细胞来源的树突状细胞体内免疫治疗后对肿瘤的抑制作用,采用了ＨＥ染色和电镜等技术,分析肿瘤组织的病理学变化。结果：ＩＬ－１２诱导ＦＢＬ－３细胞产生的ＤＣ,在体外可诱导出ＦＢＬ－     

5-Aza-CdR诱导肿瘤细胞NY-ESO-1抗原的表达

目的：探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-CdR）对肿瘤细胞中NY-ESO-1抗原表达的诱导作用。方法：常规培养人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株H2P和MHCC97-H、人结肠癌细胞株HT-29和LoVo及人脑胶质瘤细胞株U251,RT-PCR和免疫细胞化学法检测5-Aza-CdR作用前后肿瘤细胞中NY-ESO-1 mRNA和蛋白的表达。结果：RT-PCR与免疫细胞化学检测仅见胃癌SGC-7901细胞阳性表达NY-ESO-1,其余5株肿瘤细胞不表达NY-ESO-1。NY-ESO-1阴性的肝癌细胞株H2P、结肠癌细胞株LoVo及脑胶质瘤细胞株U251经5-Aza-CdR（终浓度分别为1、5和10 μmol/L）处理6 d后,细胞形态和生长速度均无明显改变,而NY-ESO-1 mRNA和蛋白均被诱导为阳性表达,并随5-Aza-CdR浓度增加而阳性表达逐渐增强。结论：5-Aza-CdR能诱导肝癌、结肠癌、脑胶质瘤等肿瘤细胞中NY-ESO-1抗原的表达,为肿瘤免疫治疗提供了一条新思路。     

NY-ESO-1蛋白在喉鳞状细胞癌中表达的意义

 目的　检测NY-ESO-1蛋白在喉鳞癌中的表达情况,探讨其作为喉癌免疫治疗靶标的实验依据及其与喉癌生物学行为的关系。方法　免疫组织化学PV-9000两步法检测69例喉鳞癌患者原发灶及其常规病理报告为阳性的121个颈淋巴结中NY-ESO-1的表达,同时采用Western blotting方法检测其在喉鳞癌标本的癌中心区、癌周0.5、1.0 cm及9例全喉切除术患者的喉正常黏膜组织（对照）中的表达。结果　69例喉鳞癌组织中,NY-ESO-1蛋白表达阳性率为43.48 %（30／69）,在癌中心区、癌周0.5、1.0 cm中的表达逐渐下降（P＜0.05）,NY-ESO-1在对照组喉正常黏膜组织中无表达。NY-ESO-1蛋白在不同T分级、病理分级和不同颈淋巴结转移喉癌中的表达率差异无统计学意义（P＞0.05）,颈转移淋巴结中NY-ESO-1的表达下调。结论　NY-ESO-1在喉鳞癌患者中特异性高表达,可能以某种方式参与了喉癌的发生、发展,是否能将其作为喉癌免疫治疗靶标有待深入研究。     

肝细胞癌NY-ESO-1基因/蛋白表达与临床病理特征及肿瘤转移的关系

背景与目的:NY-ESO-1属癌症-睾丸抗原家族,能激发肿瘤患者同时产生细胞免疫和体液免疫,特异杀伤肿瘤细胞,被认为是目前免疫原性最强的肿瘤抗原。本研究旨在探讨NY-ESO-1在肝细胞癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析62例肝癌和相应癌旁肝组织NY-ESO-1m RNA表达;将145例肝癌石蜡组织制成芯片(132例有效),应用免疫组织化学EliVisionTM两步法观察NY-ESO-1蛋白的表达和分布。结果:NY-ESO-1基因在肝细胞癌中的阳性率是27.4%(17/62),肝癌伴门脉癌栓者达40%(10/25),高于不伴门脉癌栓的18.9%(7/37);NY-ESO-1蛋白主要分布在肝癌细胞胞浆,在肝癌组织芯片中的阳性率为18.9%(25/132),肝癌伴转移病变者为29.6%(16/54),不伴转移病变的阳性率仅11.5%(9/78),二者比较有显著性差异(P<0.05);NY-ESO-1基因和蛋白在H BsAg阳性肝癌标本中阳性率分别为28.3%(15/53)和19.1%(22/115),AFP≥20滋g/L标本的阳性率为29.5%(13/44)和20.7%(19/93),与H BsAg阴性和AFP正常的肝癌比较均无显著性差异(P>0.05);所有癌旁肝组织均未见NY-ESO-1的表达。结论:NY-ESO-特异表达于肝癌细胞,在有转移病变的病例中有较高的阳性率,提示NY-ESO-1可能与肝癌病情进展和转移有关,可作为肝癌,特别是伴有转移病变     

癌-睾丸抗原NY-ESO-1在食管鳞状细胞癌中的表达及其意义

目的 检测NY-ESO-1蛋白在食管鳞癌中的表达,分析其与肿瘤临床病理参数的关系以及NY-ESO-1蛋白在晚期食管鳞癌免疫治疗中的意义.方法 选取113例中晚期食管鳞癌标本构建组织芯片,应用免疫组化EnVision二步法,检测NY-ESO-1蛋白的表达,SPSS统计软件分析所得数据.结果 109例有效标本中,有32例NY-ESO-1阳性(29.4%),阳性部位在细胞浆,10例正常食管黏膜中无-例表达NY-ESO-1蛋白.NY-ESO-1蛋白的表达主要集中在肿瘤细胞分化较好的Ⅰ级和Ⅱ级食管鳞癌,阳性率有显著性差异(P＜0.01),与肿瘤的大小,浸润深度及有无淋巴结转移无关(P＞0.05).结论 NY-ESO-1是目前已知的免疫原性最强肿瘤抗原,可诱导自发的体液免疫和细胞免疫反应,其在晚期食管鳞癌中的表达提示NY-ESO-1可作为食管癌的免疫治疗的靶点.     

人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用

目的：克隆人NY-ESO-1基因，进行原核表达和分离纯化，并初步应用于肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测。方法：通过RT-PCR技术从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1基因片段，插入原核表达载体pGEX4T-1( )中，构建重组表达质粒pGEx／ESO1，导入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导目的蛋白表达，经包涵体透析复性和GSTrap亲和层析纯化目的蛋白，Westem blot鉴定。应用间接ELISA方法初步检测50例肝癌患者血清和20例正常人血清NY-ESO-1抗体的表达。结果：扩增得到NY-ESO-1基因3′端276bp片段，与GeneBank公布序列一致，构建的pGEX／ESO1原核表达质粒经IPTG诱导，在大肠杆菌中表达分子量约36kD的GST-ESO1融合蛋白，纯化后蛋白纯度为90％。50例肝细胞癌患者血清中4例检测到NY-ESO-1抗体(8％)，正常人血清均为阴性。结论：成功构建pGEX／ESO1重组表达质粒，得到有活性的NY-ESO-1融合蛋白，对肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测有-定的应用价值。     

NY-ESO-1与MAGE-A1在乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨NY-ESO-1与MAGE-A1在乳腺癌组织中的表达及意义。方法  健康对照者乳腺组织20例,不同病理类型及分级的病例90例,标本进行免疫组织化学SP法染色;采用Tanaka改良定量记分法测阳性率。结果  NY-ESO-1与MAGE-A1在正常乳腺组织中不表达;乳腺癌组织中NY-ESO-1与MAGE-A1阳性表达率分别为37.78%和23.33%;阳性表达与临床病理各参数不具有相关性(P>0.05)。结论  NY-ESO-1和MAGE-A1在乳腺癌组织中呈高特异性表达,对乳腺癌的早期诊断有一定的临床意义。     

NY-ESO-1基因在人食管癌中的表达及其基因克隆

背景与目的：NY-ESO-1是从食管癌cDNA文库中筛选到的肿瘤抗原,但是该基因在食管癌组织中的表达情况尚未见报道。本文研究NY-ESO-1基因在食管癌中的表达率,以便于确定食管癌患者是否可以使用以NY-ESO-1抗原为基础的疫苗治疗。方法：采用RT-PCR方法检测了NY-ESO-1基因在30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达;采用分子克隆的方法从食管癌组织中克隆了NY-ESO-1cDNA。结果：NY-ESO-1基因在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）,在30例相应癌旁正常组织中未见表达;克隆的NY-ESO-1cDNA序列与GenBank报道一致。结论：NY-ESO-1基因在食管癌中高频率表达,NY-ESO-1抗原可以被具有HLA-1类分子限制性CTL识别。     

NY-ESO-1 expression and its serum immunoreactivity in esophageal cancer

Purpose NY-ESO-1, a member of the cancer/testis antigen (CTA) family, elicits humoral and cellular immune responses in patients with advanced cancer. Unresectable or metastatic esophageal carcinoma patients do not benefit from the present multimodality treatment regimens in terms of survival. The objectives of this study were to analyze the antibody response to NY-ESO-1 antigen in patients with esophageal cancer and to determine the potential of NY-ESO-1 for use in tumor-specific immunotherapy.Methods Serum from 69 patients with esophageal cancer was investigated for antibody production against NY-ESO-1 by Western blot analysis. Also analyzed by immunohistochemistry were 56 tissue samples from these patients for NY-ESO-1 protein expression.Results NY-ESO-1 protein expression was found in 18 of 56 (32%) esophageal carcinomas. Serum immunoreactivity specific for NY-ESO-1 was found in 9 patients (13%) of whom 8 were in the advanced stage (stages III and IV). There was no relationship between clinicopathologic features and serum immunoreactivity for NY-ESO-1. NY-ESO-1 protein expression was detected in three of five antibody-positive patients whose tissue was available for analysis. Survival analysis showed no significant difference between antibody-positive and antibody-negative patient groups.Conclusions A humoral immune response to NY-ESO-1 antigen was established in patients with advanced esophageal cancer. NY-ESO-1 is a good candidate for vaccine-based immunotherapy for advanced esophageal carcinoma.     

AKAP4, SPAG9 and NY-ESO-1 in Iranian Colorectal Cancer Patients as Probable Diagnostic and Prognostic Biomarkers

Background and objectives: Colorectal cancer (CRC) is the most common gastrointestinal cancer and the secondleading cause of cancer death in women in the world. Cancer-Testis Antigens (CTAs) are a group of tumor-associatedproteins which typically are expressed in normal reproductive cells of men, but their expression in normal somatic cellsis silenced. CTAs, due to their limited expression pattern, are considered as promising targets for cancer diagnosis andimmuno-therapy. Methods: Expression of AKAP4, SPAG9 and CTAG1B genes from the CTAs family was studiedin both tumor and normal tissues of 62 Iranian CRC patients by RT-PCR with the aim of finding biomarkers for earlydetection and anticipated progression. Statistical analysis was performed SPSS software V22.0 to assess the significanceof any associations. Results: Elevated expression of SPAG9 and AKAP4 genes was observed in approximately 66%and 44% of tumours, respectively, as compared to adjacent non-cancerous tissues. While a significant association wasfound between AKAP4 gene expression and metastasis (P-value: 0.045), expression of the CTAG1B (NY-ESO-1) genewas not observed in our cases. Conclusion: AKAP4 and SPAG9 genes may find use as diagnostic biomarkers for CRCand AKAP4 may play an important role in progression to metastasis.