核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响.方法采用血清饥饿法同步化处理的SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞,常规超排KM小鼠获得卵母细胞,采用盲吸法去核,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎,6-DMAP+CCB+乙醇激活重组胚, CZB培养液中培养.结果电场强度(V/cm)和脉冲(ms)为 1500/30; 1500/40; 1800/30; 1800/40时,融合率为 81.5%; 83.3%; 77.6%; 82.0%.直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为33.1%和28.9%,桑椹胚发育率为17.8%和15.5%.结论电场强度为1500～1800V/cm, 脉冲为30ms或40ms时,都能获得较高的融合率;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高,但统计学分析差异不显著.     

激活方法和培养体系两种因素对大鼠-牛异种核移植重组胚胎体外发育的影响

目的 :构建大鼠 -牛异种体细胞核移植重组胚胎 ,探讨激活方法和培养体系两种因素对重组胚胎体外发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步处理的 SD大鼠成纤维细胞为供体细胞 ,以牛去核卵母细胞为受体 ,显微直接注射法构建重组胚 ,在 M199成熟培养基中 ,分别采用透明质酸酶、放线菌酮和 6- DMAP+乙醇 3种化学激活方法激活重组胚 ,并分别观察重组胚被放线菌酮激活后在 M16 、M199和改良的 CZB3种培养基中的发育情况。结果 :透明质酸酶、放线菌酮和 6- DMAP+乙醇激活重组胚胎 ,卵裂率分别是 5 .36%、1 5 .42 %、1 7.86% ;M16 、M199和改良的 CZB培养重组胚胎 ,卵裂率分别是 9.0 9%、1 6.1 7%、1 7.0 5 %。结论 :放线菌酮和 6- DMAP+乙醇均可有效激活重组胚 ;M199和改良的 CZB均可支持胚胎的体外发育 ,且二者胚胎培养的效果显著优于 M16 。     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找最佳电融合参数。方法 将直径10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4~8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1000~2000kV/cm和脉冲时程40~160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4~8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外,脉冲重复次数以1~2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响，寻找最佳电融合参数。方法 将直径10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核一卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者问的融合，并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动，变动范围分别是电场强度1000-2000kV／cm和脉冲时程40～160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核一卵母细胞复合体的融合率．而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内，供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异，并且融合后重组胚的激活，以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外，脉冲重复次数以1～2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后,将直径为10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活。体外培养72h,对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s;Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核;去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

小鼠体细胞核移植技术的初步研究

目的 :建立细胞核移植技术 ,为“治疗性克隆”的实验研究和临床应用作准备。方法 :以C5 7鼠的卵丘细胞为核供体细胞 ,去核卵母细胞为核受体进行胚胎的重构。用改良的WAKAYAMA方法 ,分别进行卵丘细胞的分离、分裂中期卵母细胞的去核、供体细胞核的注射、重构胚的电融合以及卵母细胞的活化等研究。结果 :去核卵母细胞的成活率 3 8.4%。成活的小鼠胚胎发育进入二细胞期。盲吸法比半卵法和功能性吸核的效果好。电融合法能够使移植核融入卵母细胞内。结论 :小鼠体细胞核移植技术基本获得成功     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

破坏高尔基体对小鼠体细胞核移植重组胚的构建及其体外发育的影响

目的探讨破坏高尔基体对小鼠核移植重组胚的构建及其体外发育的影响;方法采用血清饥饿法同步化处理KM小鼠成纤维细胞作为供体细胞;常规超排KM小鼠获得卵母细胞,布雷菲德菌素A（Brefeldin A,BFA）特异性破坏其高尔基体并采用盲吸法去核;直接注核法构建重组胚胎,6-DMAP＋CCB＋乙醇激活重组胚,在含5μg/mL BFA的CZB培养液中培养。结果经BFA处理后,小鼠核移植重组胚的存活率降低,与对照组存活率相比较统计学差异显著（P〈0.05）,但其卵裂率与对照组比较统计学差异不显著（P〉0.05）;     

阻断ICOS分子对小鼠移植胰岛功能的影响

目的:拟观察小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中,可诱导共刺激分子(Inducible costimulator,ICOS)的表达情况及阻断其对排斥反应的影响。方法:供体为BALB/C小鼠,受体为C57BL/6。随机分成4组,每组10只。对照组:单纯胰岛移植,不给ICOSmAb处组;实验1、2、3组:分别于移植后1、3、5d腹腔内注射ICOSmAb50、100、200?g/kg。术后观察小鼠的血糖变化和移植胰岛组织病理学改变;采用微量全血3H-胸腺嘧啶掺入法检测单个核细胞在刀豆蛋白A刺激下的增值程度;流式细胞仪检测外周血T细胞亚群及ICOS在CD4+细胞/CD8+细胞表面的表达情况。结果:实验2组小鼠血糖维持正常时间和实验3组相同,差异无统计学意义,而与对照组和实验1组相比,差异有统计学意义;术后7d,对照组和实验1组单个核细胞在刀豆蛋白刺激下的增值程度明显强于实验2组和实验3组,差异有统计学意义;术后7d,对照组和实验1组ICOS分子表达上调明显,并且以CD4+细胞表面表达为主,与实验2组和实验3组相比,差异有统计学意义;术后7d,实验2组和实验3组小鼠肾被膜下胰岛素免疫组化染色强度均高于实验1组和对照组。结论:ICOS分子在小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中表达上调,以CD4+细胞为主;ICOS单克隆抗体(ICOSmAb)通过阻断ICOS共刺激信号途径,可明显减轻小鼠胰岛移植后排斥反应的发生,显著延长移植胰岛有功能存活时间;ICOSmAb的最佳给药剂量为100μg/kg。     

猪体细胞核移植胚的体外发育及其影响因素

以卵丘细胞为核供细胞组成重构胚 ,卵裂率达以5 6 .7% ,发育至桑椹胚达 11.7%、孵化囊胚率为 6 .7% ,显著高于成纤维细胞重构胚 (P<0 .0 5 )。作者还研究了卵母细胞的采集方法、激活程序和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响 ;以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至 G0或 G1期 ,抽吸法 /解剖法采集卵母细胞 ,体外培养 33或 4 4 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中 ,重构胚以钙离子载体 A2 3817或电脉冲结合6 - DMAP激活处理 ,体外培养 6 d,结果表明 ,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素 (CB)、激活程序并不影响重构胚的发育 (以…     

CD28~+T淋巴细胞的表达与心脏移植急性排斥反应的相关性研究

目的:检测CD28+T淋巴细胞在心脏移植急性排斥反应(AR)期的表达变化情况,探讨该变化与AR相关性。方法:用流式细胞仪检测正常大鼠组(T0组)、手术创伤组(T1组)、同系心脏移植组(SD→SD)(T2组)、同种心脏移植组(Wistar→SD)(T3组)CD28+T淋巴细胞的表达百分率;并对心脏移植组AR进行分级;同时分析CD28+T与AR的相关关系。结果:T1组与T0组CD28+T淋巴细胞的表达无显著差异;T2组总体CD28+T淋巴细胞的表达水平较T0组、T1组显著增加(P<0.05)。T3组总体CD28+T淋巴细胞的表达水平较T0组、T1组增加更显著(P<0.01)。同种心脏移植组AR显著高于同系心脏移植组。T2、T3心脏移植组CD28+T与AR严重程度成显著正相关。结论:心脏移植AR严重程度与CD28+T表达增高成正相关,CD28+T表达增高预示急性排斥反应的发生。     

胎肝细胞宫内胎鼠腹腔注射对其移植免疫反应的影响

目的 研究胎肝细胞宫内注射对小鼠移植免疫反应状态的影响。方法 利用C57BL／6小鼠的胎肝细胞对BALB／c胎鼠行宫内胎鼠腹腔注射（孕期第14－16日），分娩存活的BALB／c雌性小鼠7－9wk时作受体，C57BL／6新生鼠作供体，行异位心肌移植，以小鼠心肌移植后的存活时间、混合淋巴细胞培养和对诱导迟发型变态反应（DTH）的影响观察该方法对小鼠移植排斥反应的影响作用。结果 和对照组相比较，宫内注射组小鼠移植一心肌存活时间明显延长，混合淋巴细胞培养等结果也具有显性差异（P＜0.01）。结论 胎肝细胞宫内注射的方法可以延长小鼠心肌移植的存活期，对小鼠移植掩护反应可以起到明显的抑制作用。     

Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation in the treatment of severe aplastic anemia and severe infection

Severeaplasticanemia (SAA)ischaracterizedbyafailureofbloodcellproductionresultinginseverepancytopeniawithamarkedlyhypocellularbonemarrow Bonemarrowtransplantation (BMT)isoneofthecurativeapproachesinpatientswithSAA Peripheralbloodstemcelltransplantation(PBSCT )hasbeenmainlyusedinthetreatmentofmalignanttumors Recently ,successfulsyngeneicandallogeneicPBSCTinpatientswithSAAwasreported ,1 3 　andsomewasasasalvagetreatmentinpatientswithSAAwhofailedtoBMT 4,5Wesuccessfullycompletedanallo…     

雷帕霉素对小鼠移植排斥反应及免疫功能的影响

目的：研究雷帕霉素（rapamycin, RAPA）对小鼠移植排斥反应及免疫功能的影响。方法：小鼠同种异型耳后心脏移植和皮肤移植,二硝基氟苯(dinitro-fluorobenzene, DNFB)诱导的迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity, DTH）的测定,溶血素的测定, 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验。结果：RAPA可显著延长小鼠同种异型心脏及皮肤移植的存活期;显著抑制小鼠DTH反应;并使绵羊红细胞(sheep red blood cell, SRBC)致敏小鼠溶血素生成显著下降;对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红作用无明显影响。结论：雷帕霉素可抑制小鼠同种异型移植排斥反应,抑制小鼠细胞及体液免疫功能,但不影响非特异免疫功能。     

非清髓异基因造血干细胞移植造血细胞嵌合体形成及演变的临床意义

目的：探讨非清髓异基因造血干细胞移植（NAST）造血细胞嵌合体的形成及演变的临床意义。方法：采用非清髓性预处理方案治疗了42例组织相容性抗原相合的血液病患者。男26例,女16例,中位数年龄37岁（18－59岁）。非清髓预处理：白血病患者采用环磷酰胺（CTX）、阿糖胞苷及CD3单克隆抗体,6周患者在此基础上加用氟达拉滨。再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征患者采用CTX和抗淋巴细胞球蛋白。结果：42例患者均顺利渡过造血抑制期并形成造血细胞嵌合体。18例形成稳定的完全供者造血细胞嵌合体（FDC）,24例形成混合造血细胞嵌合体（MC）。其中15例逐渐转为FDC,5例保持稳定嵌合状态,4例发生移植排斥。42例中10例（23．8％）发生急性移植物抗宿主病（aGVHD).其中FDC者8／18（44．4％）,MC组2／24,FDC者的aGVHD发生率明显高于MC患者（P＜0．05）。42例中8例发生慢性移植物抗宿主病（cGVHD).FDC者4／18,MC者4／24,FDC患者的cGVHD发生率高于MC组但差异无显著意义（P＞0．05）。FDC患者和MC患者的中性粒细胞和血小板最低值及恢复时间,存活时间差异无显著意义（P＞0．05）。随访2－43个月,仍存活31例（73．8％）。结论：NAST早期先形成高比例MC再逐渐转化为FDC即可显著减轻GVHD又不降低和影响疗效,可能是造血干细胞移植更理想的植入模式。     

两种预处理方案在自体造血干细胞移植治疗自身免疫性疾病中的前瞻随机性研究

目的 探讨含／不含全身照射（TBI）作为预处理方案在自体外周血干细胞移植（APBSCT）治疗自身免疫性疾病中的造血重建、免疫重建、疗效和并发症等方面的差异。方法 自1999-2006年6月,共有32例严重的自身免疫性疾病患者接受了APBSCT。其中女性27例、男性5例,中位年龄29岁（15～49岁）。所有患者均采用环磷酰胺（CTX）＋粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）方案动员,采集物均应用CliniMACS细胞分选仪分选CD34^＋细胞。21例患者预处理方案采用CTX＋TBI,11例采用CTX＋抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。结果 两组的造血重建CTX＋TBI组粒细胞植入中位时间为11d,CTX＋ATG组为9d,组间比较差异有统计学意义（P＝0．003）。两组血小板植入的中位时间分别为13d和8d,组间比较P＝0、001;移植后12个月时两组患者淋巴细胞各亚群均已恢复,但CD4／CD8比值仍倒置,各亚群水平两组间差异均无统计学意义;所有患者随访12个月以上,CTX＋TBI组有3例（14．3％）复发,CTX＋ATG组有2例（18.2％）复发,其余患者病情稳定;移植期间CTX＋TBI组细菌感染发生率为5／21（23.8％）,病毒感染1例（4．8％）,放射性腮腺炎4／21（19％）,CTX＋ATG组细菌感染发生率为2／11（18．2％）,病毒感染2例（18．2％）,血清病反应3／12（25％）。两组患者感染均在抗生素或抗病毒治疗后很快得到控制,均无因血小板减少引起致命的出血并发症。两组患者在随访时间内均未出现肺间质纤维化、白内障等远期并发症。结论 含TBI的预处理方案在造血重建上迟于不含TBI的方案,但CTX＋TBI的耐受性好,疗效上两者无明显差异,在免疫重建方面差别不明显。