胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

腺病毒介导的HSV-tk基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的　探讨带有HSV -tk基因的重组腺病毒 (Ad -tk)结合GCV对人膀胱癌的治疗作用。方法　建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型 2 1只 ,采用肿瘤原位注射Ad -tk结合GCV治疗。结果　 5× 10 8PFU的Ad -tk肿瘤原位注射结合GCV治疗 ,能明显抑制肿瘤生长 ,肿瘤平均重量为 0 .2 1g ,病理检查表明肿瘤组织坏死、出血伴纤维组织增生 ;而 3个对照组Ad -tk/PBS组、PBS/GCV组、PBS组肿瘤平均重量分别为 1.6 0、1.5 2、1.71g。与对照组比较 ,肿瘤生长抑制率分别为 86 .9%、86 .2 %、87.7% ,有显著性差异 (均P <0 .0 1)。结论　Ad -tk/GCV系统对人膀胱癌的敏感性较高 ,疗效显著。     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

大肠癌细胞的双自杀基因治疗

目的探讨腺病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的杀伤作用及其放射增敏作用。方法用重组的腺病毒载体感染大肠癌细胞株SW480,用RT-PCR方法检测CD(cytosine deaminase)-TK(thymidine kinase)融合基因的表达,单独或联合给予前体药物GCV和5-FC后,用MTT法测定双自杀基因对大肠癌细胞的体外杀伤效应,用克隆形成实验分析感染有自杀基因的大肠癌细胞的放射增敏作用。结果感染有自杀基因的大肠癌细胞,在给予前体药物后,细胞的存活率明显下降,联合给予GCV和5-FC细胞的存活率较单独给GCV或5-FC存活率明显降低(χ2=30.371,P<0.01);联合使用5-FC和GCV时,CD-TK自杀基因的旁观者效应最明显(P<0.01);使用GCV和(或)5-FC能增加感染有自杀基因的大肠癌细胞对照射的敏感性,在联合使用前体药物时更为明显(P<0.01)。结论CD-TK双自杀基因体系对大肠癌细胞具有显著的杀伤作用和放射增敏作用,证明双自杀基因系统具有临床应用价值。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因治疗大肠癌的实验研究

目的　观察腺病毒介导下CD/5 -FC对小鼠结肠癌C2 6细胞体外、体内的治疗作用。方法　先构建通过细菌内同源重组法制备CD腺病毒 ,用Ad -CD感染体内、体外小鼠结肠癌C2 6 ,并给予前药 5 -FC ,观察其杀伤肿瘤效果。结果　Ad -CD体外感染小鼠结肠癌C2 6 ,给予前药 5 -FC后 ,可有效杀伤肿瘤细胞 ,并有明显的旁观者效应。AdCD瘤内注射腹腔给前药 5 -FC对BALB/C皮下荷瘤小鼠C2 6大肠肿瘤有较好的治疗作用 ,尤其在早期能使肿瘤生长明显减慢 ,但是未能完全消除肿瘤 ,在后期还观察到肿瘤明显生长。结论　体外腺病毒介导CD/5 -FC可以有效杀伤肿瘤细胞 ,并具有明显的旁观者效应。腺病毒介导CD/5 -FC对皮下荷瘤小鼠早期有一定的治疗作用 ,但是它不能以绝对的优势控制肿瘤的生长 ,更难以长期维持其疗效。说明这一腺病毒介导的自杀基因系统对C2 6皮下肿瘤的抑制作用是有限的。     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

【目的】探讨CEA启动子(CEA promoter，Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)与胸苷激酶(thymidine kinase，TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因。【方法】以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组，未转染者为对照组，5-氟胞嘧啶(5-fluomcytosine，5-Fc)组系列质量浓度：10、8、6、4、2、0μg／mL；更昔洛韦(ganciclovir，GCV)组系列质量浓度：5、4、3、2、1、0μg／mL；两药联合应用的系列质量浓度：(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg／mL。光镜观察细胞形态，噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate，GIR)及半数抑制浓度(IC50）。病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养，给予5-Fc 5μg／mL或，和GCV10μg／mL，噻唑蓝法测定细胞GIR。【结果】对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低，5-Fc组IC50为2400μg／mL，GCV组为3500μg/mL。实验组随5-Fc与GCV剂量增加，对细胞的杀伤作用明显增加，5-Fc组IC50为5．75μg／mL，GCV组为3．50μg／mL两者同时应用相当于5-Fc 1．90μg/mL GGV0．95μg／mL，细胞对5-Fc的敏感性提高417．4倍，对GCV的敏感性提高1000倍。病毒杀伤Lovo细胞具有明显的“旁观者”效应，联合应药组的“旁观者”效应明显高于单独应用组。【结论】双自杀基因细胞毒效应以及“旁观者”效应均高于单一自杀基因。     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

[目的]探讨CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因.[方法]以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组,未转染者为对照组,5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)组系列质量浓度:10、8、6、4、2、0μg/mL;更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组系列质量浓度:5、4、3、2、1、0μg/mL;两药联合应用的系列质量浓度:(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg/mL.光镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate,GIR)及半数抑制浓度(IC50).病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养,给予5-Fc5μg/mL或/和GCV 10μg/mL,噻唑蓝法测定细胞GIR.[结果]对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低,5-Fc组IC50为2 400 μg/mL,GCV组为3 500μg/mL.实验组随5-Fc与GCV剂量增加,对细胞的杀伤作用明显增加,5-Fc组IC50为5.75μg/mL,GCV组为3.50 μg/mL,两者同时应用相当于5-Fc1.90 μg/mL GCV 0.95 μg/mL,细胞对5-Fc的敏感性提高417.4倍,对GCV的敏感性提高1 000倍.病毒杀伤Lovo细胞具有明显的"旁观者"效应,联合应药组的"旁观者"效应明显高于单独应用组.[结论]双自杀基因细胞毒效应以及"旁观者"效应均高于单一自杀基因.     

CD、TK双自杀基因对消化道肿瘤细胞的体外抑制作用

目的 用粘粒法构建含有胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk)双自杀基因的腺病毒载体，检测双自杀基因对不同消化道恶性肿瘤细胞的体外抑制作用。方法 利用重组腺病毒载体介导的CD、HSV－tk融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、胃癌细胞系SGC－7901、肝癌细胞系BEL－7402，通过MTT法测定细胞存活率，通过细胞集落形成实验分析GCV（丙氧鸟苷）、5－FC（5－氟胞嘧啶）双前药（double prodrugs)对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观效应的大小。结果 Western blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自杀基因可以在3种肿瘤细胞中高效表达。使用前药GCV和5－FC后，各组肿瘤细胞的集落形成和细胞存活率显低于对照组。感染细胞在混合细胞中比例较低时，就能获得明显的旁观效应。联合两种前药能获得最大的细胞抑制作用，并且CD／5－FC系统对于消化道肿瘤细胞的杀伤作用强于HSV－tk/GCV系统。结论 CD、TK融合基因联合双前药治疗对消化道肿瘤有显的体外抑制作用。     

肝癌自杀基因治疗研究新进展

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一 ,恶性程度高 ,预后差。尽管其诊治水平不断提高 ,世界每年因肝癌致死的病人仍达百万人之多。传统的手术、放化疗等手段可一定程度改善早期病人的预后 ,但对转移、复发及中晚期患者却无能为力。随着分子生物学技术的不断进展、人们对肿瘤分子机制研究的不断深入 ,利用肿瘤与正常组织基因及调控区域的结构差异 ,从分子水平特异性杀伤肿瘤细胞的基因治疗成为肿瘤治疗中极具应用潜力的新策略。肝癌的发生并非某个基因的单独作用 ,而是一个多基因多阶段的复杂过程 ,因而不依赖于肿瘤细胞的遗传背景 ,直接向肿瘤细胞引…     

CD-TK双自杀基因系统对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨CD-TK融合双自杀基因对前列腺细胞的杀伤作用.方法 应用缺陷性腺病毒载体将CD-TK融合双自杀基因以及绿色荧光蛋白基因(GFP)转染RM-1细胞,以GFP是否表达作为间接鉴定转染成功的标志,以RT-PCR鉴定作为是否转染的标准.联合前药5-FC和/或GCV作用于转染了CD-TK基因的RM-1细胞,以MTT法检测自杀基因系统对转染后的RM-1细胞的杀伤作用,以未转染的RM-1细胞作对照.结果 以腺病毒感染RM-1细胞72 h后,在荧光显微镜下可见每个细胞都能发出淡绿色荧光,表明该基因已转染到RM-1细胞中,RT-PCR可检测到转染双基因的RM-1细胞含有CD-TK基因.与对照组相比较,当GCV浓度为125 μg/ml时,转染了CD-TK基因的RM-1细胞的存活率为47.27%;与对照组相比较,当5-FC浓度为160 μg/ml时,RM-1细胞的存活率为71.56%;而两种前药联合应用时RM-1细胞的存活率为18.45%,低于单一用药组(P＜0.05).结论 CD/5-FC、TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌细胞具有较强的杀伤作用,而应用CD-TK融合自杀基因系统明显优于单一的自杀基因系统.     

联合自杀基因及内皮抑素基因双靶点治疗膀胱癌的实验研究

目的 探讨基因重组腺相关病毒自杀基因及内皮抑素(KS)联合基因治疗膀胱癌的效果.方法 (1)通过重组腺相关病毒(rAAV)-增强绿色荧光蛋白(EGFP)转染膀胱肿瘤T24细胞,来确定rAAV对该细胞的转染情况及转染效率;(2)通过rAAV-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-ES(简称rAAV-TIE)体外转染T24膀胱肿瘤细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞),应用MTT法、流式细胞仪等方法 来检测其对T24细胞及HUVEC细胞凋亡的诱导作用;(3)构建裸鼠膀胱癌模型,分析rAAV-TIE联合基因治疗膀胱癌的体内效果.结果 (1)rAAV-EGFP转染T24细胞后可以表达携带的外源基因EGFP;(2)rAAV-TK、rAAV-TIE转染T24细胞72 h后,流式细胞仪检测结果 显示,rAAV-TK、rAAV-TIE两组凋亡率分别是34.12%和36.91%,明显高于空病毒转染组[rAAV-多克隆位点(MCS)组](3.08%)和空白对照组(0.84%);(3)瘤内注射rAAV-KS、rAAV-TK、rAAV-TIE大约9 d后,肿瘤生长受到显著抑制,治疗结束后:各组肿瘤的体积分别是:rAAV-Es组(0.75±0.08)cm3、rAAV-TK组(0.71±0.11)cm3、rAAV-r11E组(0.52±0.09)cm3、rAAV-MCS组(1.27±0.13)cm3和空白对照组(1.24±0.17)cm3,除rAAV-ES组与rAAV-TK组间比较差异无统计学意义外,其余组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 体外和体内实验表明rAAV-TIE可有效抑制膀胱癌的血管生成和肿瘤的生长,能够双靶点基因治疗膀胱肿瘤.     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.     

重组腺病毒Ad-CD/TK对人肝癌细胞的作用

目的:通过构建含CD/TK双自杀基因的重组腺病毒,探讨治疗肝细胞癌的途径.方法:目的基因CD/TK,自真核载体pCEA-CD/TK中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,构建成转移质粒pAdtrack-CMV-CD/TK,经PmeⅠ酶切后与pAdeasy-1质粒混匀共转化细菌BJ5183,挑选克隆pAd-CD/TK,经PacⅠ酶切后转染293细胞,PCR鉴定后,在人肝癌细胞中测定其感染效率并观察其体外对人肝癌细胞的作用.结果:pAdtrack-CMV-CD/TK和pAd-CD/TK经酶切鉴定正确,pAd-CD/TK转染293细胞,制备腺病毒后,发现其对人肝癌细胞有较高的感染效率,给予氟胞嘧啶后,发现被感染细胞能够被杀死,并具有很高的旁观者效应.结论:构建的含CD/TK双自杀基因的重组腺病毒对人肝癌细胞有较高的感染效率,在体外观察到对人肝癌细胞有较好的杀灭作用.     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

TK自杀基因的构建及鉴定

目的利用分子生物学技术,构建胸苷激酶基因（TK）自杀基因并测定其结构,为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础。方法以人类单纯疱疹病毒Ⅰ（HSV1）基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应（PCR）法,扩增出约为1 100 bp TK基因,定向克隆到载体PEGM-T,构建克隆载体。两端分别引入限制性内切酶NotⅠ、XholⅠ酶切位点,经PCR及酶切鉴定初步证实为重组体后,测序认证。结果经PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成TK基因的构建,同源性高达98.70%,完全具备表达该目的基因的要求。结论成功扩增出TK基因,为继续研究打下基础。     

HSV-TK/GCV系统致鼠膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨HSV-TK/GCV(单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷)系统杀伤鼠膀胱癌细胞T739的机理。方法T739与T739-TK细胞经0.25、4和8μg/ml的GCV处理后,分别观察细胞形态变化、DNA电泳和流式细胞仪检测等。结果经GCV处理过T739-TK细胞DNA电泳均发现阶梯状DNA,T739细胞电泳条带无特殊。流式细胞仪检测,T739-TK细胞均发现极明显的亚G1峰,而T739细胞无此峰发现。结论HSV-TK/GCV系统可诱导携有HSV-TK基因的T739细胞发生凋亡。