人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞表型及免疫功能变化

目的 探讨膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞(dendritic cells,DCs)的表型及免疫功能变化.方法 通过密度梯度离心法从膀胱肿瘤患者和正常人外周血分离单个核细胞,加rhGM-CSF和rhlL-4诱导培养树突状细胞,采用流式细胞仪检测2组DCs表达程序性死亡配体-1(PD-L1)、CDla、HLA和CD83的变化,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖能力和ELISA法检测分泌IL-10和IL-12的变化.结果 膀胱肿瘤患者外周血DCs表达PD-L1[(95.06±4.06)％ vs (76.63±6.90)％]和分泌IL-10[(214.00±13.75) pg/mL vs(83.78±7.95) pg/mL]的水平显著高于正常组(P＜0.05),DCs表达CD83[(16.20±1.91)％ vs (35.53±1.58)％]及刺激淋巴细胞增殖的能力均低于正常组水平(P＜0.05).结论 膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞高表达PD-L1、低表达CD83及过多分泌IL-10可能是膀胱肿瘤发生免疫逃逸的原因之一.     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

胃癌患者外周血树突状细胞的分离与培养

目的探讨从胃癌患者外周血分离与扩增树突状细胞（dendritic cells,DCs）的有效方法。方法从胃癌患者外周血分离出贴壁单个核细胞,实验组将其与细胞因子GM—CSF、IL-4和TNF—α共同培养,对照组不加细胞因子,动态观察细胞生长情况,流式细胞仪检测实验组不同培养时相细胞表面分子CD86、CD80、HLA-DR的表达水平,并和对照组比较。结果与对照组比,实验组诱导出大量具有典型形态的DCs,培养至第7天,胃癌患者外周血DCs细胞表型表达较第3天增高非常显著（P〈0．01）,与对照组相差显著（P〈0．01）;培养第12天,DCs细胞表型表达与第3天比较相差非常显著（P〈0．01）,与培养第7天比较相差不显著（P〉0．05）,与对照组相差显著（P〈0.01）。结论联合应用GM-CSF、IL-4和TNF-α能有效的从胃癌患者外周培养出大量具有活性的DCs。     

不同来源树突状细胞的培养研究

目的比较不同来源的树突状细胞(DC)在体外扩增、分化成熟的特点.方法将骨髓和外周血采集物作为DC的培养源,联合GM-CSF、IL-4细胞因子培养DC,观察培养过程中DC的超微结构变化,检测其免疫表型.结果外周血采集物培养的DC成熟明显早于骨髓采集物培养的DC(P＜0.01).DC表型CDI a-PE、HLA-DR-PE、CD54-FITC、CD80-FITC的阳性率平均值在骨髓组和外周血组分别为23.3±3.6和25.8±2.2、95.0±2.1和96.9±1.0、54 4±1.4和56.1±1.2、40.5±2.7和41.7±1.8(P＞0.05).结论外周血组DC表型的阳性率稍高于骨髓组,但获取费用较昂贵,适用范围有限;骨髓来源则较简便,但培养成熟时间较长,且受个体差异的限制.     

外周血来源树突状细胞的体外诱导及鉴定

目的 建立人外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)的分离方法,观察其形态学和免疫组织化学的特点,为下一步研究提供DC来源.方法 用重组人GM-CSF、IL-4从人外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测所得细胞的纯度,光镜、电镜观察其形态,SP免疫细胞化学方法检测DC的分子表达.结果 此纯化方法所得细胞纯度可达到80%以上,形态学观察可见纯化细胞具有典型的DC特征,该细胞高表达HLA-DR和S-100分子.结论 此种方法可获得较高纯度典型的DC,为进一步研究及临床应用提供了可能.     

人外周血来源的树突状细胞的体外诱导培养

目的：从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞(DC)。方法：将外周血单个核细胞用贴壁法分离出单核细胞,经多细胞因子联合诱导出DC。结果：培养8～9d后即可获得大量高纯度的成熟DC,经流式细胞仪检测,所得细胞中高表达共刺激分子和粘附分子,表现为成熟DC的特征。结论：利用多细胞因子组合可从外周血诱导大量成熟DC,为DC的临床应用提供依据。     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞及鉴定

目的：建立体外从健康成人外周血单核细胞（Mo）诱导培养成熟的树突状细胞（DE）的方法。方法：采用连续贴壁法分离正常人外周血单核细胞,在GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养。培养5天后收集细胞,重新铺板后继续在TNF-α的完全培养基中培养48小时后,收集细胞和上清液,采用流式细胞术检测DC表型CD80、CD83、CD40的表达;用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-12的浓度;用倒置显微镜动态观察DC形态变化。结果：采用连续贴壁法和用GM—CSF、IL-4和TNF—α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞,且高表达CD80、CD83、CD40,表达率分别为84．29％、90．73％、92．38％。DC分泌的细胞因子IL-12浓度为38．52±11．34pg／ml。结论：采用连续贴壁法和用GM．CSF、IL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养大量的树突状细胞,检测表型CD80、CD83、CD40的表达率和细胞因子IL-12浓度可以鉴定树突状细胞。     

华蟾素对正常人外周血来源树突状细胞的影响

目的:从树突状细胞(DCs)的分子细胞水平初步探讨华蟾素提高机体免疫力的作用机制。方法:分离正常人外周血单核细胞,以GM-CSF IL-4培养诱导DCs,采用自身配对设计分成对照组和华蟾素组(DCs培养48小时后加入华蟾素)。培养第7天镜下观察两组细胞形态的异同,用流式细胞仪检测DCs表面分子的表达水平,用CCK8检测DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,用ELISA法检测DCs培养液上清中IL-12的水平。结果:华蟾素组DCs与对照组比较细胞形态相对成熟,表面分子表达水平增高,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和IL-12分泌能力增强。结论:华蟾素能增强正常人DCs的功能。     

黄芪多糖对子宫内膜癌患者外周血单核细胞源性DCs成熟的影响

目的探讨黄芪多糖对子宫内膜癌患者外周血单核细胞源性树突状细胞（DCs）成熟的影响。方法从子宫内膜癌患者外周血中分离单核细胞,以加入IL-4、GM-CSF树突状细胞专用培养基培养5d后,以不同浓度的黄芪多糖（终浓度分别为0、50mg/L、100mg/L、150mg/L）刺激48h,镜下观察DCs形态变化,采用流式细胞术检测树突状细胞表型CD1α、CD83、CD86的表达,以及ELISA法检测细胞上清液中IL-12的含量。结果 150mg/L APS组细胞生长状态最好,具有典型的树枝状突起;150mg/L APS组、100mg/L APS组DCs表面CD1α、CD83及CD86的表达较对照组、50mg/L APS组明显上调（P〈0.05）;150mg/L APS组、100mg/L APS组细胞上清液中IL-12含量高于对照组、50mg/L APS组（P〈0.05）。结论黄芪多糖可促进子宫内膜癌患者外周血单核细胞源性DCs成熟以及IL-12的分泌。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞免疫功能的研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)表面分子HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86表达水平及其与DC免疫功能的相关性。方法　临床确诊的慢性乙型肝炎轻度患者 1 0例 ,从其外周血中分离单个核细胞 ,体外培养扩增DC ,流式细胞仪检测DC表型HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86。以健康成人 1 0例作为对照。结果　慢性乙型肝炎患者DC表面HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86分别为 :48.63± 6.34,2 7.73±7.1 9,2 1 .0 5± 8.33,1 8.5 8± 5 .5 1 ,明显低于对照组 :83.1 1± 6.46,5 2 .80± 1 1 .70 ,36.1 1± 7.5 5 ,40 .83± 5 .48,两者相比差异显著 (P <0 .0 0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC表面HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86表达水平下降 ,并与DC免疫功能低下密切相关     

MAGE-3抗原肽致敏DC疫苗抗膀胱癌细胞的体外实验

目的探讨黑色素瘤MAGE-3抗原肽致敏的树突状细胞(DC)疫苗体外抗膀胱癌细胞增殖作用及其分子机制。方法采用Ficoll法从HLA-A2型外周血中分离单核细胞,细胞因子GM-CSF和白细胞介素4(IL-4) 诱导扩增DC细胞后经MAGE-3抗原肽致敏,致敏DC细胞和同型T淋巴细胞共培养法诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。MTT法检测抗原肽致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响,CTL对靶细胞BIU-87的杀伤作用。采用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡和凋亡相关蛋白变化。结果MAGE-3抗原肽致敏的DC对T淋巴细胞增殖率具有明显提高作用,高于无关抗原致敏DC及未致敏DC。经MAGE-3九肽冲击的DC可有效诱导对MAGE-3阳性细胞BIU-87杀伤的CTL活性,而无关抗原肽及未经抗原肽致敏的DC则不具备其杀伤能力。结论MAGE-3九肽致敏DC能显著促进T淋巴细胞增殖并诱导有效杀伤靶细胞的CTL作用。     

树突状细胞在膀胱移行细胞癌和区域淋巴结中的浸润及其意义

目的　研究树突状细胞 (DC)在膀胱移行细胞癌和区域淋巴结中的浸润状况 ,探讨其抗肿瘤免疫作用。方法　4 9例膀胱移行细胞癌石蜡标本和 6 8枚盆腔淋巴结石蜡标本 ,用SP法检测DC在肿瘤微环境中的浸润分布 ,并对浸润细胞数目进行计数。结果　DC在高分化癌组织中的浸润数目多于中分化和低分化 ,差异有极显著性 (P <0 .0 1) ;术后生存期超过 5年的患者癌组织中DC的浸润多于术后生存期低于 5年者 ,差异有极显著性 (P <0 .0 1) ;无转移者的淋巴结中DC浸润数目多于有转移者 ,差异有极显著性 (P <0 .0 1)。结论　DC在膀胱移行细胞癌组织微环境和区域淋巴结中的浸润 ,反映了机体的抗肿瘤能力 ,可以作为判断其预后的指标之一     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养及功能研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)免疫诱导T淋巴细胞增殖的能力及其与DC免疫功能的相关性。方法　慢性乙型肝炎患者 1 0例 ,从外周血中分离单个核细胞 ,在含rhGM -CSF、rhIL - 4、TNF -α的完全培养基中诱导培养为DC ,并与同种异体T细胞作用 ,用液体闪烁仪观察DC对T细胞增殖的作用。另选取健康成人 1 0例作为正常对照。结果　慢性乙型肝炎患者组DC其诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力每分钟液闪计数 (cpm为 1 0 635± 876) ,明显低于正常对照组 (cpm为 42 91 8±7889,P <0 .0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC免疫功能低下     

膀胱癌患者一氧化氮对外周血树突状细胞的影响

目的: 观察外源性一氧化氮(nitric oxide, NO)对膀胱癌患者外周血树突状细胞(dendritic cell, DC)的影响. 方法: 膀胱癌患者外周血中分离出单个核细胞,用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)培养DC细胞. 外源性NO干预后DC刺激自体淋巴细胞的增殖和细胞毒性T细胞(CTL)对膀胱癌T-24的杀伤效应,用MTT法检测. 结果: 外源性NO可明显抑制DC刺激的自体淋巴细胞增殖,在NO浓度分别为50, 100, 200和400 nmol/L时淋巴细胞增殖率分别为(67±3)%,(40±6)%,(24±2)%和(18±3)%(与对照相比P<0.01);显著下调DC诱导CTL杀伤T-24的细胞毒作用,用相同的NO浓度梯度干预,杀伤率分别为(45±4)%,(38±3)%,(32±3)%和(22±1)%(与对照相比P<0.01). 未受干预的DC能显著引起淋巴细胞的增殖,增殖率为(74±6)%;无NO干预DC诱导的CTL能特异性杀伤膀胱癌T-24,杀伤率为(54±3)%. 结论: 外源性一氧化氮能引起膀胱癌患者DC递呈抗原能力的下降,下调由DC刺激的淋巴细胞增殖及DC诱导的CTL杀瘤效应.     

胃癌患者外周血DCs细胞表型变化研究

目的　研究胃癌患者外周血树突状细胞 (DCs)细胞表型表达水平 ,与正常人DCs细胞表型表达进行比较并分析其临床意义。方法　分离培养胃癌患者及正常人外周血DCs ,流式细胞仪检测细胞表型表达变化。结果　培养第 3天 ,DCs细胞表型表达均较低 ,两组之间差异不显著 ;培养第 7天 ,两组培养DCs细胞表型表达均较第 3天显著升高 ,且两组之间差异非常显著 ;培养第 12天 ,DCs表型表达较培养第 3天差异非常显著 ,较培养第 7天差异不显著 ,两组之间差异显著。结论　外周血培养DCs的细胞表型表达随培养时间推移而升高 ,至细胞成熟时趋于稳定 ;胃癌患者DCs细胞表型表达较正常人显著降低 ,了解胃癌患者体内DCs细胞表型表达水平 ,对评判患者预后及生物治疗疗效有一定的参考价值。     

不同大肠癌细胞裂解物负载健康人外周血DC瘤苗的体外试验研究

目的探讨3种大肠癌肿瘤细胞裂解物负栽的健康人外周血树突状细胞（DC）刺激同体和异体T淋巴细胞增殖活化的作用。方法对血站来源的健康人外周血采用密度梯度离心法,分离获得DC前体细胞,用临床应用药物GM—CSF、TNF—a和试验用试剂rhlL-4联合诱导培养扩增Dc,制备3种大肠癌细胞裂解物,体外致敏DC,显微镜观察Dc形态演化过程,电镜拍摄微观形态特征,流式细胞仪鉴定DC表型,ELlSA法检测肿瘤抗原致敏DC分泌IL-12水平,检测致敏DC刺激T淋巴细胞分泌的IL—lO和IF阿7水平,3H—TdR法检测成熟DC（mDC）诱导同体和异体T淋巴细胞增殖能力。结果DC形态学呈现典型树突状分化特征,mDC表达特征性免疫表型CDla、CD83,共刺激分子CD86、HLA—DR,分泌高水平IL—12,mDC与同体和异体T淋巴细胞共培养均能有效刺激T淋巴细胞增殖活化,T淋巴细胞不分泌IL-10,分泌较高水平IFN-了,3W480细胞株在各项指标上都具优势,3H—TdR法检测提示mDC不仅可以刺激同体淋巴细胞增殖,同样有效激活异体T淋巴细胞。结论来源于血站的健康人外周血是-种方便的DC前体细胞原料。联合细胞因子的培养方法可以成功诱导出成熟的DCl型细胞,引起Thl型细胞免疫反应;3种大肠癌肿瘤细胞裂解物,尤其是Sw480细胞株裂解物抗原性质稳定,能够有效促进DC分化,提高DC成熟度;负载裂解物的DC不仅刺激同体T淋巴细胞增殖,也可有效激活异体T淋巴细胞增殖,因此应用健康人异体来源的DC瘤苗刺激患者T淋巴细胞增殖,从而产生抗肿瘤免疫反应的设想是可行的。     

口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性

目的:研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法: 口腔癌患者(实验组)及正常人(对照组)15例外周血单个核细胞经GM-CSF,IL-4及TNF-α诱导培养, 获取成熟DC, 光镜和电镜观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLA-DR等分子的表达变化,用噻唑蓝(MTT)法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果: 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养,均诱导出具有典型形态和表型的DC,其中实验组细胞的CD83,CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3,与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差异有统计学意义(P＜0.05),CD86,CD80和HLA-DR的表达率分别为85.5±8.7,83.2±8.1和78.3±5.4,与对照组三者表达率89.2±6.7,87.7±7.2和82.3±4.1相比无明显统计学差异(P＞0.05);实验组DC细胞CD83,CD1a,CD86,CD80和HLA-DR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13,3.96±1.15,12.33±6.75,19.63±8.12和39.44±7.9, 均低于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力. 结论: 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC,该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.